Molecular analysis of early specification in the mollusc Patella vulgata
Year: 2001
Type: dissertation
Abstract: Mollusken (o.a. slakken) maken deel uit van de enorm grote groep van\ninvertebraten. De vroege ontwikkeling van de mollusk Patella vulgata is bestudeerd\nals modelsysteem voor de mollusken. De vroege ontwikkeling van deze zeeslakken\nkenmerkt zich door enerzijds de manier van klieven, namelijk spiraalklieving, en\nanderzijds door de vorming van een larvaal stadium, de trochophora larve. De\ntrochophora beweegt zich voort met behulp van een geciliëerde band met cellen,\ngenaamd de prototrooch. De eerste cellen worden al zeer vroeg in de ontwikkeling\ngevormd tijdens de vierde klieving waardoor een 16-cellig embryo ontstaat. Vier cellen\nzullen differentiëren (zich ontwikkelen) tot primaire trochoblasten, die nog twee maal\ndelen en daarna ciliën gaan vormen. In dit onderzoek is gekeken naar hoe deze cellen\nweten dat ze trochoblastcel zijn, met name welke factoren hiervoor bepalend zijn.\nAl sinds 1900 wordt gedacht dat deze factoren door de moederslak in de eicel\nworden geplaatst, vandaar de naam maternele factoren, en door de delingen specifiek\nin de trochoblast cellen terecht komen. Dit proces hebben wij op een moleculair niveau\nbestudeerd. De trochoblast cellen brengen als enige cellen vanaf het 32-cellig stadium\neen tubuline gen tot expressie, wat leidt tot de aanmaak van tubuline eiwit dat nodig is\nvoor de ciliën. De regulatie van dit tubuline gen is bestudeerd op het niveau van\ntranscriptie, het overschrijven van het DNA op het chromosoom wat leidt tot de\naanmaak van een boodschapper molecuul (mRNA) dat later vertaald wordt in een\neiwit. Verschillende factoren zijn noodzakelijk voor deze transcriptionele regulatie,\nnamelijk specifieke stukken in het gen, de cis-acting elementen, en trans-acting\nfactoren die daar aan kunnen binden, ook transcriptiefactoren genaamd. Voor de\nregulatie van het tubuline gen zijn twee cis-acting elementen onmisbaar, é é n element\nwaar een remmende factor aan kan binden en é é n element waaraan een activerende\nfactor bindt. In hoofdstuk 3 zijn de resultaten van de zoektocht naar de trans-acting\nfactoren die aan deze cis-acting elementen binden beschreven. Met een\nSouthwestern assay, waarin de binding van eiwitten aan stukjes DNA kan worden\nbestudeerd, is vastgesteld dat de activerende factor waarschijnlijk een klein eiwitje met\neen molecuulgewicht dat kleiner is dan 20 kDalton. Andere eiwitten die ook aan de\nbelangrijkste cis-acting elementen binden met molecuulgewichten van 42 and 55\nkDalton werden tevens gevonden. Verder tonen gel shift experimenten aan dat er\nverschillende factoren binden aan de belangrijkste cis-acting elementen op\nverschillende tijdstippen van de ontwikkeling van de larve, wat zou kunnen betekenen\ndat er verschillende factoren nodig zijn voor het aanschakelen van het tubuline gen\ntijdens de vroege ontwikkeling en voor het onderhoud van de tubuline expressie later. We hebben geprobeerd om deze factoren met verschillende methoden uit embryos te\nzuiveren, maar dat is niet gelukt. Met behulp van Cytochalasine B experimenten is\nverder bepaald dat de factoren nodig voor tubuline expressie in de trochoblast cellen al\naanwezig zijn in de moedercellen van de trochoblasten op het 8-cellig stadium, de\nmicromeren, en niet in de overige cellen, de macromeren. Tevens is de correcte\nvorming van de micromeren en de macromeren tijdens de derde klieving, namelijk de\nvorming van een animale laag (aan de bovenkant) van vier micromeren bovenop vier\nmacromeren aan de vegetatieve kant (onderkant) van het embryo, noodzakelijk voor\ncorrecte tubuline expressie (hoofdstuk 2).\nEen tweede strategie om de maternele factoren die door de moederslak in het\nembryo geplaatst worden en die van belang zijn voor het bepalen van de identiteit van\neen cel, te isoleren was de uitvoering van een differential display. Er is gekeken naar\nverschillen in boodschapper moleculen (mRNAs) tussen de micromeren en\nmacromeren, die coderen voor factoren die de ontwikkeling gaan bepalen. Dit heeft de\nisolatie van drie interessante eiwitten opgeleverd. Het eerste is glutaredoxin (mi9), een\neiwitje dat andere eiwitten kan modificeren door een redox reactie, een chemische\nreactie door uitwisseling van zuurstof atomen (hoofdstuk 5). Dit eiwitje kan mogelijk\ntranscriptiefactoren die de ontwikkeling van een cel bepalen modificeren en als\nzodanig de ontwikkeling van bepaalde cellen beïnvloeden. Verder is een\ntranscriptiefactor geïsoleerd, mi10, die de transcriptie van verschillende genen kan\nreguleren (hoofdstuk 6). Tenslotte Esther32 (E32), een RNA-bindend eiwit, wat de\naanmaak van bepaalde eiwitten kan beïnvloeden (hoofdstuk 7). Het mRNA voor dit\neiwit komt specifiek in bepaalde cellen voor, die gekenmerkt worden door het feit dat\nze nog delen. Niet delende cellen die al gedifferentiëerd zijn, zoals de trochoblasten in\nde prototrooch hebben E32 mRNA niet. Dit suggereert dat E32 een rol speelt bij het\nbepalen wanneer een cel stopt met delen en gaat differentiëren. De precieze rol van\ndeze eiwitten tijdens de vroege ontwikkeling van Patella vulgata moet verder\nonderzocht worden.\nVerder is er gekeken of het mechanisme dat de trochoblasten in Patella embryos\ngebruiken voor hun differentiatie ook voor komt bij andere diersoorten die ook een\nspiraalklieving hebben (hoofdstuk 4). Eerst is gekeken naar andere slakken (van het\nfylum Mollusca), namelijk de soorten Dentalium en Acantochiton. Deze slakken\nbrengen het tubuline gen van Patella ook specifiek in de trochoblast cellen tot\nexpressie, waaruit kan worden afgeleid dat de factoren nodig voor de expressie van het\ntubuline gen aanwezig zijn in deze slakken en dat deze slakken waarschijnlijk\nhetzelfde mechanisme gebruiken voor de expressie van hun eigen tubuline in de\ntrochoblast cellen. Dit zou betekenen dat dit mechanisme voor trochoblast specifieke\ntubuline expressie evolutionair geconserveerd is in de mollusken en daarom al\nwaarschijnlijk aanwezig was in de voorouder van de slakken. Er is ook gekeken naar\nandere soorten, namelijk de polychaete ringwormen Platynereis, Nereis en\nChaetopterus (fylum Annelida), de ribbon worm Cerebratulus en de platworm\nHoploplana. Van deze wormen brachten é é n embryo van de ringworm Platynereis en meerdere embryos van de ribbonworm Cerebratulus het Patella tubuline tot\nexpressie. Omdat in de laatste embryos het tubuline gen niet specifiek in de\ntrochoblasten tot expressie werd gebracht, is het nog niet geheel duidelijk of het\nmechanisme voor trochoblast specifieke tubuline expressie ook buiten het fylum\nMollusca geconserveerd is.\nDe experimenten beschreven in dit proefschrift geven aanleiding tot nadenken\nover de manier waarop cellen tijdens de vroege embryogenese van de mollusc Patella\nvulgata gespecificeerd worden. Ondanks dat er sterke aanwijzingen zijn dat de\ntrochoblasten gespecificeerd worden door de aanwezigheid van gelocaliseerde\nmaternele factoren, is het niet gelukt om differentiëel gedistribueerde factoren te\nisoleren. In tegenstelling tot de differentiële distributie van mRNAs die coderen voor\nfactoren betrokken bij determinatieprocessen in andere soorten zoals de fruitvlieg\nDrosophila, zijn er in Patella geen differentiëel gedistribueerde mRNAs gevonden op\nhet 8-cellig stadium. Wel zijn er aanwijzingen gevonden dat door middel van\nmechanismen op het niveau van de vertalen van mRNAs (translatie) en\neiwitmodificatie (post-translationele modificatie) een differentiële activiteit van\ndeterminerende factoren verkregen kan worden. Esther 32 is een RNA-bindend eiwit\nen zou de translatie van bepaalde voor specificatie belangrijke mRNAs kunnen\nbeïnvloeden. Glutaredoxin kan eiwitten, waaronder mogelijk transcriptiefactoren, post-translationeel\nmodificeren en de activiteit van mi10, een transcriptiefactor, wordt\nmogelijk gereguleerd door fosforylatie.
Author: J. Klerkx
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W1504832263