Protein-monolayer interactions investigated by fluorescence microscopy and correlation spectroscopy
Year: 2013
Type: other
Abstract: A membrana celular é composta por uma ampla variedade de lípidos e proteínas. Através do estabelecimento de interacções entre lípidos e proteínas, quer membranares quer solúveis, podem ser originadas heterogeneidades espaciais, levando à formação de ‘jangadas lipídicas’. Estes domínios transitórios desempenham um papel fundamental em diferentes cadeias de sinalização celular. Apesar da investigação desenvolvida na área, a membrana celular é ainda hoje um dos componentes celulares menos bem compreendidos. Nas últimas décadas têm vindo a surgir um conjunto de diferentes metodologias in vitro que permitem o estudo de variados processos biológicos sob condições definidas e controladas. Neste sentido, foram desenvolvidos variados modelos membranares minimalistas, como GUVs (giant unillamelar vesicles), GPMVs (giant plasma membrane vesicles) and SLBs (supported lipid bilayers), permitindo a análise das interacções lípido-proteína até a um nível unimolecular. Quando correctamente aplicados estes modelos permitem simplificar o sistema isolando virtualmente o fenómeno ou a partícula de interesse retendo, porém, as suas características fundamentais. Apesar da vantagem evidente do uso destes modelos, estas abordagens experimentais são tediosas, envolvendo geralmente o uso de amostras de elevado volume e em que a variação de certas características membranares (como a difusão lipídica) é apenas possível por alteração da composição lipídica ou da temperatura. As monocamadas lipídicas são historicamente descritas como o primeiro sistema lipídico observado, formando-se por distribuição espontânea de moléculas lipídicas sobre a interface água - ar e formação de filmes finos sobre superfícies. Dado o seu design único, a mobilidade e compactação lipídica podem ser facilmente ajustadas neste sistema modelo por compressão da monocamada depositada na interface. Apesar de o seu uso em ensaios de ligação proteica, este sistema tem sido negligenciado na investigação membranar recente devido à sua restrita aplicação. Mais concretamente, as tinas de Langmuir comercialmente disponíveis não são compatíveis com microscopia confocal, estando assim limitadas à monitorização da pressão superficial (π). Além disso, dado o volume de cada amostra relativamente elevado (cerca de 100 mL), são necessárias elevadas quantidades de proteína purificada, comprometendo assim a sua aplicação em estudos biológicos. Neste estudo, foi utilizada uma nova tina miniaturizada de área fixa, desenvolvida no grupo por Chwastek (Chwastek & Schwille, 2013). As suas dimensões reduzidas permitem não só o uso de amostras de pequeno volume (cerca de 200 μL) como também conferem a versatilidade necessária para o seu acoplamento a um microscópio confocal. Deste modo, é possível aplicar técnicas de imagiologia de alta resolução (permitindo a eliminação de ruído de fundo, o controlo de profundidade de campo e a compilação de secções ópticas de amostras espessas oferecido pelo microscópio confocal), assim como espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS – técnica espectroscópica cuja sensibilidade advém do uso de baixas concentrações de sonda e na consequente medição de flutuações espontâneas da intensidade de fluorescência que resultam de desvios estocásticos do sistema relativamente ao seu equilíbrio térmico). O objectivo global deste projecto prende-se com a melhor compreensão da interacção estabelecida entre proteínas e monocamadas lipídicas. Mais concretamente foi medida a ligação a monocamadas lipídicas de duas proteínas estruturalmente bem caracterizadas: a estreptavidina – proteína tetramérica solúvel com elevada afinidade de ligação para a biotina (KD ≈ 10-15 M); e a toxina da cólera – enterotoxina, secretada pela bactéria Vibrio cholerae, constituída por um anel homo-pentamérico de subunidades B (CtxB5), responsável pela sua ligação ao receptor membranar gangliósido GM1 (KD ≈ 10-9 ou 10-10 M), e uma subunidade A com actividade de ribosilação que é parcialmente internalizada pelas células do hospedeiro, perturbando cascatas celulares de sinalização e desencadeando a infecção colérica. Foram realizadosensaios de ligação proteica a monocamadas lipídicas homogéneas e com separação de fases, na ausência ou presença dos respectivos ligandos específicos, de modo a distinguir e caracterizar os diferentes comportamentos proteicos. Em última análise, procurou-se desenvolver e optimizar um ensaio universal e quantitativo de ligação proteica a membranas lipídicas. Previamente aos estudos das interacções proteína-monocamanda, procedeu-se à caracterização morfológica das monocamadas lipídicas, assim como da mobilidade lipídica, recorrendo a microscopia confocal e a FCS, respectivamente. Observou-se pois que a fluidez e homogeneidade global das monocamadas é acompanhada pelo aumento linear do coeficiente de difusão em função da densidade lipídica no intervalo estudado (50 a 90 MMA – área molecular média em Å2), tal como se prevê do modelo de área livre (free area model). Mais, os valores obtidos para o ponto crítico do DMPC (36.0 ± 4.7 e 37.2 ± 13.5 Å2 em misturas marcadas com sondas diferentes) encontram-se dentro do erro dos valores descritos na literatura. Apesar da robustez demonstrada pelo sistema, é porém necessário ter em conta a possibilidade de ocorrerem desvios em extremos de densidade lipídica (50 e 100 MMA), por formação de fases S (sólida) e G (gás), respectivamente. Após validação da metodologia proposta, procedeu-se ao estudo da influência da compactação lipídica na ligação proteica à monocamada – quer com a estreptavidina, quer com a CtxB5 observou-se uma preferência para a ligação a monocamadas de baixa densidade lipídica e, correspondentemente baixa π e elevada difusão lipídica. Estes resultados são ainda suportados pelas experiências realizadas em misturas lipídicas com separação de fase – ambas as proteínas apresentam uma elevada afinidade para a fase fluida LE (liquid expanded) em comparação com os domínios compactos LC (liquid condensed). Adicionalmente, resultados de titulações de monocamadas com CtxB5 apontam para a mesma tendência visto que a 90 MMA se obtêm intensidades de fluorescência proteica ao nível da monocamada superiores que a 50 MMA. Este comportamento já tinha sido proposto no início da década de 80 tendo por base a análise de variações de π por adição proteica a monocamadas lipídicas (Phillips et al, 1975; Fidelio et al, 1981; Cumar et al, 1982). Porém, no caso da estreptavidina observa-se ainda um comportamento extraordinário de acumulação nas bordas de domínios quando a diferença na organização lipídica entre diferentes fases é muito elevada. A especificidade de ligação foi apenas possível para a CtxB5 por incorporação de GM1 na monocamada. Titulações de monocamadas demonstraram que a presença de uma baixa concentração do gangliósido (0.1 mol %) é suficiente para aumentar fortemente a ligação da proteína à monocamada. Além disso, em sistemas lipídicos homogéneos a proteína retém apreferência por baixas densidades lipídicas. Porém, na presença de separação de fases, a presença de GM1 promove a ligação de CtxB5 a domínios LC, dado que este se incorpora preferencialmente em domínios rígidos. Apesar da elevada reprodutibilidade associada às medições em lípidos, a aplicação do sistema a proteínas tem um erro associado bastante elevado que impede ainda uma quantificação exacta da sua ligação aos lípidos. É de salientar que para além da elevada sensibilidade do sistema de detecção usado, as monocamadas lipídicas formadas sobre a interface água-ar são altamente sensíveis a diferentes factores externos (p.e. oxidação lipídica, formação de menisco e não homogeneidades da compactação lipídica aquando da deposição lipídica, evaporação da subfase, deposição proteica, etc.) que ainda não são totalmente controladas. Deste modo, é ainda necessário proceder à optimização do método de modo a poder determinar-se KD da ligação de proteínas à superfície lipídica. Este projecto resultou pois na obtenção de novos dados semi-quantitativos de que a compactação lipídica desempenha um papel importante na interacção proteína-membrana. A separação de fases surge pois como um mecanismo de regulação da ligação proteica, não só por controlo da mobilidade lipídica mas também por segregação de ligandos. Em suma, a abordagem aqui proposta surge como uma alternativa poderosa para estudos de interacções membrana-proteina, permitindo o fácil ajuste de parâmetros membranares como a compactação lipídica, difícil de regular em sistemas de bicamadas. A sua combinação potente com a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de fluorescência resulta não só numa elevada resolução temporal da mobilidade de partículas lipídicas, como também na alta resolução espacial da ligação proteica. Deste modo, o trabalho apresentado contribuiu para a aproximação ao desenvolvimento de um novo ensaio quantitativo global de ligação proteica a membranas lipídicas.
Source: Max Planck Digital Library
Authors: Khmelinskaia, A., Chwastek, G., Schwille, P.
Institutions: Max Planck Society, Max Planck Institute of Biochemistry
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W1518285983