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Aislamiento y análisis del grado de fosforilación de los neurofilamentos de líquido cefalorraquídeo de pacientes con paraparesia espástica tropical

Year: 2006
Type: dissertation
Study design: Observational Study
Abstract: La patología neurológica conocida como paraparesia espástica tropical o \nTSP/HAM (“tropical spastic paraparesis/HTLV-I associated myelopathy”) se produce \npor la infección con el retrovirus HTLV-I. El material genético del virus se inserta \nmayoritariamente en el DNA de los linfocitos T-CD4+, pero no en el neuronas, desde \ndonde produce la secreción de proteínas virales como la proteína Tax. Esta enfermedad \nes crónica y lentamente progresiva donde se observa una degeneración con \ndesmielinización de los axones de las neuronas motoras superiores del haz corticoespinal. \nLa patogenia de esta patología no está aún claramente comprendida. \nEstudios en muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con diversas \nenfermedades neurodegenerativas correlacionan el daño con la hiperfosforilación de las \nsubunidades de los neurofilamentos (NFs), lo que provoca una alteración del ensamblaje \nde sus tres subunidades (NF-L, neurofilamento liviano; NF-M, neurofilamento mediano; \nNF-H, neurofilamento pesado). En este trabajo se plantea que productos virales podrían \nproducir una desregulación de la fosforilación/desfosforilación de los NFs porque \nestudios in vitro e in vivo han mostrado que la proteína Tax inhibe a la fosfatasa PP2A, y \nactiva a algunas quinasas. \nEl objetivo central de esta investigación fue determinar si en esta patología hay \ncambios en los niveles de las subunidades de los NFs y su grado de fosforilación \nmedidos en muestras de LCR de pacientes con TSP/HAM y controles. Para llevar a \ncabo esto se procedió a determinar mediante métodos inmunológicos los niveles de las \ndistintas subunidades de los NFs junto con la existencia de diferencias en el grado de \nfosforilación de residuos de treonina y serina. Para poder hacer a futuro, análisis \nproteómico por Espectrometría de Masas de las formas fosforiladas de NF-L, NF-M y \nNF-H, se emplearon diversas técnicas de afinidad. Estas incluyeron inmunoprecipitación \ncon anticuerpos mono y policlonales específicos para las tres subunidades y uso de \ncolumnas de Ga3+, las que presentan afinidad por péptidos fosforilados. \nLos resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas en los \nniveles/mg de albúmina de la banda de 66 kDa de NF-L en el LCR de pacientes y \ncontroles, pero sí un aumento significativo en los de una banda de 59 kDa, la cuál podría \nser un producto de degradación del NF-L. No fue posible asociar la banda de 66 kDa con \nel nivel de fosforilación en treonina y serina por la amplia banda inmunoreactiva frente a \nanticuerpos contra fosfotreonina y fosfoserina. La banda de 59 kDa no mostró señal con \nestos anticuerpos contra residuos fosforilados, indicando que su nivel de fosforilación \ndebe ser menor que el de la banda de mayor masa molecular. La detección de NF-M \nrequirió la previa concentración del LCR por precipitación de proteínas con acetona, y \ncondiciones distintas en el “immunowestern blot” que las utilizadas para el NF-L. Se \nobservó la presencia de dos bandas de masas moleculares 170 y 150 kDa reconocidas \npor los anticuerpos contra NF-M. De estas dos bandas se encontró que el nivel de la de \n150 kDa estaba significativamente disminuido en los pacientes, respecto a los controles. \nEstas dos bandas mostraron un patrón similar de fosforilación en treonina y serina, no \nencontrándose diferencias entre ambos grupos. \nNo fue posible detectar la presencia de la subunidad de NF-H ni siquiera en el \nLCR concentrado. Sólo se observaron bandas entre 100 y 200 kDa después de \ninmunoprecipitarla, dependiendo de la técnica empleada para dicho propósito. \nEl aislamiento de NF-L se realizó mediante dos técnicas de inmunoprecipitación \ncon anticuerpos unidos no covalentemente a proteína A/G agarosa o unidos \ncovalentemente a CNBr-Sefarosa, encontrándose que esta última mostraba menos \nproteínas contaminantes para su posterior análisis por Espectrometría de Masas. La \ncolumna de Ga3+ fue adecuada también, puesto que se observó un patrón de bandas \nreactivas contra NF-L, similar al del inmunoprecipitado. \nAplicando la técnica de inmunopecipitación con proteína A/G agarosa para el NFM, \nse obtuvo el mismo patrón de bandas inmunoreactivas utilizando anticuerpos contra \nNF-M, que el observado en LCR concentrado. \nEn resumen, estos resultados mostraron en LCR de pacientes con TSP/HAM un \naumento de una banda proteica que podría corresponder a NF-L parcialmente \ndegradado, y una disminución de la banda de menos masa molecular de NF-M. No se \npudo determinar por este método inmunológico diferencias en el grado de fosforilación del NF-L entre ambos grupos. En el caso de NF-M sí se pudo asociar las bandas \ncorrespondientes a NF-M con la presencia de fosforilaciones en treonina y serina, sin \nembargo no se encontraron diferencias significativas entre los dos grupos de estudio. \nPara futuros análisis de proteómica se demostró en esta memoria que la \ninmunoprecipitación de NF-L desde LCR mediante la técnica que utiliza anticuerpos \nunidos covalentemente a Sefarosa evita la contaminación de los anticuerpos primarios \nfacilitando los análisis por Espectrometría de Masas. En el caso de NF-M, por su masa \nmolecular se podría utilizar cualquiera de las dos metódicas. Por otra parte, la \ncromatografía de Ga3+ requiere de mayores estudios para determinar su aplicación en el \naislamiento de NFs fosforilados.
Language: Spanish
Subfield: Immunology
Open Access status: green
OpenAlex ID: W1581033084
Cites: 71
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