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Modélisation dynamique de cultures de cellules CHO produisant un anticorps monoclonal en mode cuvée-alimentée

Year: 2015
Type: dissertation
Abstract: La production d'anticorps monoclonaux par culture de cellules de mammiferes est une technologie desormais etablie industriellement qui a evolue enormement au cours des dernieres decennies. En progressant par experimentation et par intuition, des ameliorations importantes ont ete accomplies concernant la productivite des cultures et la croissance des cellules CHO, mais les niveaux de productivite et de reproductibilite sont variables d’un bioprocede a l’autre. En parallele, de nombreux travaux ont ete consacres a l'etude du metabolisme de ces cellules afin d'en relever les reactions limitantes et ainsi d'optimiser les conditions de culture. En combinant a la fois ces connaissances sur le metabolisme et les resultats observes en bioreacteurs, il a ete possible d'optimiser les strategies d'alimentation et ainsi d'optimiser la composition du milieu de culture en cours de culture, en mode cuvee-alimentee. Ces travaux ont generalement fait appel a une serie de cycles d’essais/erreurs guides par l’intuition ainsi que par des plans experimentaux tres lourds a mettre en oeuvre. Toutefois, l'analyse du metabolisme cellulaire et l'optimisation d’un procede necessitent idealement des outils qui sont a la fois descriptifs et predictifs, permettant aussi bien d'analyser les resultats experimentaux que d'explorer des pistes de solution quant a l’optimisation du bioprocede. C'est dans cette optique de developpement d'un modele mathematique qui satisfait a ces conditions que s'inscrit ce memoire.Dans le corps de ce travail, un modele dynamique du metabolisme de cellules CHO est presente et analyse. Ce modele utilise comme entrees uniquement les conditions initiales d’une culture, c'est-a-dire les concentrations initiales extracellulaires et intracellulaires en nutriments et metabolites, afin de simuler les profils de concentrations de ces composes (intracellulaires et extracellulaires), en plus de la concentration cellulaire et la production d'anticorps dans le temps. Un tel modele dynamique devrait egalement permettre de simuler les nombreux flux metaboliques en jeu. Le modele est base sur la description des flux metaboliques par des equations representant des mecanismes biochimiques connus et sur la stoechiometrie du metabolisme central du carbone, incluant la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques, la voie des pentoses phosphates, le metabolisme des acides amines) et du metabolisme energetique de la cellule. Le modele a ete adapte a partir de travaux precedents de modelisation du metabolisme d’une autre lignee de cellules CHO, et a ete construit de maniere a pouvoir simuler efficacement le metabolisme face a des perturbations du milieu extracellulaire, particulierement v par rapport a des variations de compositions du milieu initial et par rapport a l'application de differentes strategies d'alimentation en cours de culture (i.e. mode cuvee-alimentee). Afin d’assurer la robustesse de la structure (i.e. reseau metabolique) du modele ainsi qu’une estimation adequate des valeurs des parametres cinetiques, le modele a ete calibre a partir de quatre cultures en bioreacteurs. Ces cultures ont ete effectuees en utilisant deux milieux differents, une culture en mode cuvee et une culture en mode cuvee alimentee pour chaque milieu. Une analyse de sensibilite a ete effectuee pour identifier les 20 parametres les plus sensibles du modele et les valeurs de ceux-ci ont ete optimisees de maniere a reduire l'ecart entre les simulations et les valeurs experimentales. Cet exercice a de plus permis de localiser les voies metaboliques ou oeuvrent les parametres les plus importants. L'exercice d'optimisation a ete effectue en utilisant l'ensemble des cultures realisees, puis a ete repete en utilisant differents sous-ensembles de parametres, soit : seulement les cultures en mode cuvee, seulement les cultures en mode cuvee alimentee, ainsi que selon le milieu de culture utilise. La comparaison des valeurs de parametres obtenues et leur intervalle de confiance (95 %) a permis de determiner qu'un seul ensemble de parametres est suffisant pour decrire les cultures de CHO independamment du mode de culture ou du milieu de culture utilise. Des resultats similaires ont ete obtenus lorsque l'on a compare l’erreur globale de simulation des quatre cultures, soit en divisant ces dernieres en deux phases successives (phase exponentielle, puis plateau) et en utilisant d’un seul bloc l’ensemble de chacune des cultures sans changement de parametres. En outre, l'analyse des flux metaboliques effectuee, par simulations, a permis de constater que le metabolisme cellulaire est generalement tres robuste et est peu affecte par les perturbations exterieures testees ici. Ces resultats permettent de confirmer l'applicabilite du modele pour comparer differents types de milieux de culture et de strategies d'alimentation. Le modele propose dans le cadre de ce memoire de maitrise est donc utile puisqu'il permet de predire le comportement de cellules CHO selon differentes strategies de cultures, ouvrant la voie pour des applications utiles a la planification d'experience et a l'optimisation de bioprocedes de production. ---------- The production of monoclonal antibody (mAb) by mammalian cell culture is now a well established technology, after decades of intensive research. Significant improvements have been achieved through experimentation at all bioreactor scales, mainly based on intuition, enabling current production bioprocesses reaching high productivity while maintaining high cell concentration for extended time. Indeed, a significant amount of work has been made studying and describing CHO cell metabolism, identifying metabolic traits associated to culture behaviour. Combining these knowledge on cell metabolism and from bioreactor cultures, it was possible to optimize culture media composition as well as bioreactor culture feeding strategies. However, bioprocess productivity and reproductivity level vary among biosystems. Indeed, an efficient analysis of cell metabolism and process optimization require tools that can be descriptive and predictive, proposing optimized solutions and analyzing experimental results . With that in mind, the present masters thesis’ aim was to propose a mathematical model that satisfies those criteria. A dynamic model of CHO cells metabolism is thus presented in this thesis, calibrated, analyzed and challenged with experimental data. The model, having as only input the culture initial conditions such as the extracellular and intracellular concentrations of nutrients and metabolites, simulates the concentration profiles of metabolites (intracellular and extracellular), cell growth, antibody production as well as metabolic flux dynamics. The model includes the kinetic description of the metabolic flux rates by equations derived from known biochemical mechanisms, and mass balances based on the stoichiometry of the cell's central carbon metabolism including glycolysis, TCA cycle, pentose phosphate pathway amino acid metabolism, mAb synthesis and energetic metabolism. The model presented here represents a further development from previous work on the modeling of another CHO cell line. It is specifically designed to simulate the effect of environmental disturbances such as variations of the initial medium compositions and of nutrients feeding strategies. In order to fine-tune the model structure as well as the values of the kinetic parameters, the model was calibrated on four different bioreactor cultures. Batch and fed-batch cultures were performed using two different media. A sensitivity analysis was performed on model parameters of which 20 were identified as the most sensitive ones, which values have been optimized to minimize the simulation error with respect to experimental data. This was also helpful to identify the metabolic vii pathways affected by the most sensitive parameters. The model parameter values optimization step was performed following various strategies: using experimental data of all cultures, and distinct data subsets such as batch or fed-batch cultures only, and for each culture media. Studying confidence intervals (95%) of model parameter values determined from each data sets, we show that a limited set of model parameters could describe CHO cultures irrespectively to the medium composition or the batch and fed-batch strategy. Similar conclusion can be drawn dividing the culture into exponential growth and plateau phases, estimating distinct parameter values in each phase, versus a model that simulates the entire culture without any parameters change. The resulting model was then used to perform a dynamic metabolic flux analysis, which revealed that the metabolism of the recombinant CHO cell line in this study is highly robust and highly regulated; the external perturbations having little effect on flux distribution. This work thus confirms the applicability of the dynamic model as an in silico platform to study different types of culture media and medium feeding strategies. The model could be used to help plan experiments or to optimize culture process.
Language: French
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2114943240
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