Analysis of DNA Recombination Proteins in DNA Damage Response
Year: 2005
Type: dissertation
Abstract: Chromosomen zijn de dragers van ons erfelijk materiaal. Alle informatie die onze lichaamscellen nodig hebben om te leven, te functioneren als cel en als onderdeel in een bepaald lichaamsdeel en over te dragen op een volgende generatie is hierin opgeslagen. Het is zo belangrijk, dat de cel van elk chromosoom twee kopieën heeft. Chromosomen zijn, onder andere opgebouwd uit DNA, waarin de erfelijke eigenschappen zijn opgeslagen in een specifieke volgorde van bouwstenen.Het DNA staat constant bloot aan beschadiging. Zo vinden er elke dag tussen de 10.000 en 1.000.000 DNA beschadigingen in onze cellen plaats als gevolg van blootstelling aan schadelijke stoffen, maar ook als gevolg van biologische processen in ons lichaam waarbij eveneens schadelijke stoffen ontstaan. DNA schade moet dus elke dag op grote schaal gerepareerd worden en ook nog nauwkeurig: ongerepareerde of onnauwkeurig gerepareerde schade leidt tot veranderingen in ons DNA die we mutaties noemen. Mutaties staan aan de basis van kanker, een van de meest verspreide ziektes in de moderne wereld. Hoe belangrijk DNA herstel is voor ons lichaam blijkt wel uit het onderzoek naar DNA herstel: vele mutaties die DNA herstel mechanismen aantasten zorgen al voor dood in het embryonale stadium en andere, minder ernstige mutaties hebben kanker of andere symptomen tot gevolg. Zonder DNA herstel mechanismen zouden wij waarschijnlijk een minder lang en minder prettig leven hebben. \n \nDit proefschrift beschrijft mijn studie over de reactie van de recombinatie eiwitten, Rad51 en Rad54, op DNA schade in zoogdiercellen. Homologe recombinatie is een DNA herstelmechanisme dat dubbelstrengsbreuken (DSB) en kruisverbindingen in het DNA herstelt. Het zijn zeer schadelijke types DNA schade, waarbij een laesie in een cel al de dood tot gevolg kan hebben voor deze cel. Deze types DNA schade worden onder meer veroorzaakt in de kliniek tijdens röntgen en chemotherapie, want de bedoeling van deze therapieën is om zoveel schade aan het DNA van tumorcellen toe te dienen dat ze sterven, maar de naburige gezonde cellen niet. Zo blijkt dus dat het onderzoek naar DNA herstel niet alleen belangrijk is voor het begrijpen van het ontstaan van kanker, maar ook voor het genezen ervan. \n \nHoofdstuk één geeft een overzicht weer van het belang van DNA herstel, de niveaus van onderzoek, de types DNA schade, de bijbehorende herstelmechanismen en andere functies van homologe recombinatie, een bepaald soort DNA schade herstelmechanisme dat centraal staat in dit proefschrift. Ook wordt daar dieper ingegaan op het herstel van DSBs, waar behalve homologe recombinatie ook een ander, minder precies herstelmechanisme beschikbaar voor is. Homologe recombinatie, een nauwkeurig herstelmechanisme, maakt gebruik van een onbeschadigd, identiek stuk DNA (de homoloog) om het beschadigde stuk te repareren. Hierbij moet, na vaststellen van de schade en het voorbewerken van de beschadigde stukken, eerst het identieke stuk DNA worden opgespoord. Daarna wordt het ontbrekende of beschadigde stuk gekopieerd van de homoloog, waarna beide DNA moleculen weer uit elkaar gaan. De recombinatieherstel eiwitten Rad51 en Rad54 spelen een rol bij het opsporen, kopiëren en uit elkaar gaan van het gebroken DNA molecuul en zijn homoloog. \nAls men met behulp van een microscoop het gedrag van deze eiwitten volgt, dan kan men zien dat, na het toedienen van DNA schade (DSBs, kruisverbindingen) deze eiwitten in de celkern samenklonteren tot foci. Van deze eigenschap van Rad51 heb ik gebruik gemaakt door DNA schade gevoelige mutanten te testen op hun mogelijkheid om toegediende schade te herstellen door middel van homologe recombinatie. Het voordeel is dat men niet alleen het effect van bekende mutaties op recombinatieherstel kan bekijken, maar ook dat van onbekende. Op die manier is ook gebleken dat de mutatie in de stralingsgevoelige hamstermutant VC-8 het borstkankergen2 (BRCA2) aantast. Dit staat allemaal beschreven in hoofdstuk twee. \nOok in hoofdstuk drie is gebruik gemaakt van de focusformatie van Rad51, in dit geval om het functioneren van het andere recombinatie-eiwit, Rad54, onder de loep te nemen. Het laatste vormt ook foci in antwoord op DNA schade en de focusformatie van beide eiwitten blijkt inderdaad specifiek te zijn voor de typen DNA schade waarvoor recombinatieherstel nodig is. Ook is Rad54 vrij belangrijk voor Rad51 focusformatie: de Rad54KO mutant cellen hebben duidelijk moeite met het vormen van stabiele Rad51 foci in reactie op ioniserende straling. Het Rad54 eiwit blijkt het makelijker te maken voor dubbelstrengs DNA, waarbij beide strengen om elkaar heen zijn gewonden, om lokaal te ontwinden, waardoor er een opening in het dubbelstrengs DNA ontstaat. Dit zou een stabiliserende ofwel stimulerende rol kunnen hebben bij het vormen van de zogenaamde joint molecule (JM), een structuur waarbij het gebroken DNA molecuul het intacte, homologe DNA binnenkomt om een kopie te maken voor het herstel. \nIn hoofdstuk vier worden deze bevindingen, samen met recente resultaten over Rad54 van andere onderzoeksgroepen besproken en in perspectief geplaatst. \nIn hoofdstuk vijf wordt weer gebruik gemaakt van de focusformatie van recombinatie-eiwitten als gevolg van DNA schade. In dit geval is gebruik gemaakt van Rad54 als indicatoreiwit. Echter, in tegenstelling tot de vorige hoofdstukken wordt er geen directe DNA schade in de cellen geïnduceerd. Dit keer wordt een DNA replicatieremmer, genaamd hydroxy-ureum (HU), gebruikt. Zoals uitgelegd in hoofdstuk een (sectie 1.5) spelen recombinatie-eiwitten namelijk ook een rol in de bacteriële DNA replicatie. In zoogdiercellen wordt een soortgelijke rol vermoed, maar harde bewijzen zijn er vooralsnog niet. HU stopt de DNA replicatieprocessen en toediening van dit stofje zet cellen aan tot Rad54 focusformatie. Focusformatie kan geïnduceerd zijn omdat het ontstaan van DSBs een neveneffect is van HU behandeling. DSBs ontstaan vlakbij de plaats waar de DNA replicatie gestopt is. De Rad54KO mutant cellen bevatten inderdaad significant meer DSBs na HU behandeling dan normale cellen. Echter, onder de experimentele condities is DSB herstel moeilijk uit te voeren en dan is recombinatieherstel capabele cel niet in het voordeel op een hersteldeficiënte cel. Dus de opeenhoping van DSBs in de mutant hoeft geen gevolg te zijn van het defect in DSB herstel. Bovendien blijken in HU behandelde cellen de geïnduceerde Rad54 foci veel sneller te verdwijnen dan in bestraalde cellen, zodra de cellen de kans krijgen om de schade te herstellen. Waarschijnlijk zijn de HU geïnduceerde foci gerelateerd aan de stopgezette replicatie, terwijl de stralingsgeïnduceerde foci gerelateerd zijn aan het herstel van de ontstane DSBs. Een replicatiegerelateerde functie van Rad54 zou kunnen liggen in het beschermen of verwerken van de stopgezette replicatie waardoor er minder DSBs ontstaan.
Author: Thomas Tan
Language: English
Topic: DNA Repair Mechanisms
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2127017467