Year: 2010
Type: dissertation
Abstract: Argomento di questa tesi di dottorato sono i polisaccaridi (sia capsulari, CPSs, sia esopolisaccaridi, EPSs), prodotti da batteri e rilasciati nell’ambiente circostante, ed il loro ruolo nelle infezioni batteriche. Sono stati presi in considerazione batteri opportunisti responsabili di infezioni polmonari in pazienti affetti da fibrosi cistica (CF). I risultati riportati in questa tesi di dottorato comprendono diverse linee di ricerca e contribuiscono a chiarire le diverse caratteristiche chimiche e biologiche dei polisaccaridi batterici presi in considerazione. \n\tLa prima linea di ricerca riguarda due EPSs strutturalmente simili prodotti da Inquilinus limosus, un batterio recentemente isolato dalle secrezioni polmonari di pazienti con CF. Si è voluto valutare se i due EPSs fossero in grado di assumere conformazioni differenti e quindi ipoteticamente producessero diverse attività biologiche. Le proprietà conformazionali sono state valutate mediante misure di dicroismo circolare ed immagini ottenute mediante microscopia a forza atomica. Studi di modellistica molecolare sono stati effettuati dalla Dr.ssa M. Kuttel (Dip. di Chimica, Univ. di Cape Town). I due polimeri esibiscono effettivamente differenti conformazioni elicoidali (strutture secondarie), che vengono stabilizzate da legami idrogeno e caratterizzate dalla presenza di gruppi piruvato carichi esposti sulla superficie esterna dell’elica. Questo risultato conferma l’ipotesi che la biosintesi di più specie polisaccharidiche può risultare un mezzo utile per il batterio per diversificare i propri strumenti di difesa da possibili minacce esterne. \n\tLa seconda linea di ricerca ha preso in considerazione l’esopolisaccaride cepaciano, prodotto dalla maggioranza dei ceppi appartenenti al complesso della Burkholderia cepacia (Bcc). L’unità ripetitiva (RU) di questo EPS è stata isolata dalla membrana interna batterica, dove si trova legata a un trasportatore lipidico prima della polimerizzazione. Durante il lavoro di questa tesi, è stato sviluppato un protocollo per isolare l’unità ripetitiva e la sua RU biologica è stata determinata mediante analisi ESI-MS. Questo studio, che nasce dalla collaborazione con la Dr.ssa C. Lagatolla (Dip. di Scienze della Vita, Univ. di Trieste), impegnata nella ricerca dei geni coinvolti nella biosintesi del cepaciano, ha inoltre permesso di determinare lo schema di acetilazione della stessa, utile per la possibile comprensione del ruolo biologico dei gruppi acetili, e di investigare alcuni passi del processo biosintetico dell’unità ripetitiva del polisaccaride. \n\tL’utilizzo di enzimi in grado di degradare il polisaccaride cepaciano è utile per demolire la matrice esopolisaccaridica presente attorno ai batteri e consentirne l’utilizzo in sinergia con terapie antibiotiche. In precedenza era stato trovato un enzima, prodotto da un ceppo ambientale di Bacillus, con attività liasica verso il cepaciano. Il suo isolamento per un futuro sequenziamento è stato oggetto di questa tesi. Questo enzima è in grado di idrolizzare una catena laterale dello scheletro polisaccaridico del cepaciano, così lasciando intatta la natura polimerica dell’EPS. Benché l’eliminazione di questa catena laterale provochi una decisa diminuzione della viscosità, probabilmente dovuta alla perdita di aggregazione, la ricerca di altri enzimi in grado di idrolizzare lo scheletro polimerico a frammenti a basso peso molecolare sarà oggetto di ricerche future. \n\tLa quarta linea di ricerca ha coinvolto lo studio dell’interazione tra diversi EPSs con tre peptidi antimicrobici del sistema dell’immunità innata, appartenenti alla famiglia delle catelicidine. Negli esperimenti sono stati utilizzati esopolisaccaridi prodotti da Pseudomonas aeruginosa, Inquilinus limosus e ceppi clinici del Bcc. L’inibizione dell’attività dei peptidi è stata valutata tramite saggi di minima concentrazione inibente su un ceppo di Escherichia coli di riferimento in presenza o meno degli EPSs. La formazione di complessi tra peptidi ed EPSs è stata studiata per mezzo di misure di dicroismo circolare, di spettroscopia di fluorescenza e di microscopia a forza atomica. E’ stato infine proposto un modello in cui peptidi strutturati ad α-elica interagiscono con gli esopolisaccaridi mediante interazioni elettrostatiche e non covalenti. \n\tInfine, la ricerca ha coinvolto il polisaccaride capsulare prodotto da Neisseria meningitidis gruppo A, usato per sviluppare un vaccino coniugato dal Prof. N. Ravenscroft (Dip. di Chimica, Univ. di Cape Town). In base alle sue osservazioni sulla scarsa reattività del polisaccaride durante il processo di derivatizzazione necessario per la coniugazione con le proteine, è stata formulata l’ipotesi di una possibile aggregazione del polisaccaride capsulare in presenza di ioni Ca2+, derivanti dal processo di purificazione dello stesso. Per capire e risolvere questo problema, le proprietà conformazionali e morfologiche del CPS in presenza di ioni NH4+, Na+ e Ca2+ sono state studiate nel laboratorio di Trieste, mediante tecniche quali dicroismo circolare, spettroscopia di fluorescenza, viscosimetria e microscopia a forza atomica. La presenza di ione ammonio porta le catene polimeriche ad una conformazione più allungata, mentre lo ione sodio favorisce il ripiegamento delle catene in una conformazione globulare. L’addizione di calcio produce aggregazione di un limitato numero di polisaccaridi globulari per formare una struttura ‘toroidal-like’. Questi risultati giustificano la bassa solubilità del polimero in forma calcio e offrono una spiegazione della sua bassa reattività nella preparazione del coniugato proteico.
Author: Michela Foschiatti
Language: English
Subfield: Food Science
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2138726553