Coupling of atherosclerosis progression and bone disturbances in a mouse model
Year: 2015
Type: dissertation
Abstract: As doenças que afectam o sistema cardiovascular e o osso estão entre as doenças que causam maior morbilidade e mortalidade na população, em especial a aterosclerose e a osteoporose. Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado que estas duas doenças podem estar relacionadas de alguma forma, uma vez que ambas as patologias estão normalmente presentes no mesmo doente. Doentes com patologia cardiovascular apresentam um risco 1.2 a 6.7 vezes maior de sofrer de fraturas de fragilidade comparando com a população em geral, e esta associação também foi demonstrada em doentes com uma massa óssea reduzida que têm um risco aumentado de desenvolver doenças ao nível cardiovascular, em especial doentes com doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistémico ou a artrite reumatoide. A aterosclerose é caracterizada pela acumulação de partículas lipídicas e células do sistema imunitário que levam ao estreitamento do lúmen das artérias, e numa fase mais avançada do processo pode ocorrer ruptura destas placas ateroscleróticas com possível formação de trombos. Estudos recentes têm demostrado o envolvimento do sistema imune na patogénese da aterosclerose. Este processo é iniciado pelos monócitos que posteriormente se diferenciam em macrófagos com capacidade de acumular lípidos no citoplasma formando as conhecidas foam cells, ou células espumosas, com capacidade de produzir citocinas pro-inflamatórias. Estas citocinas desempenham diversas funções no organismo, mas estão maioritariamente associadas a processos inflamatórios, processos estes que levam à progressão da aterosclerose, mas também estão associados a outras patologias como a osteoporose. A osteoporose é uma doença resultante de um desequilíbrio no turnover ósseo, caracterizada pela perda de massa óssea, com alteração da microarquitectura do osso, diminuição da densidade mineral óssea e consequente aumento das fraturas de fragilidade. A associação entre estas duas patologias tem ganho robustez especialmente com o paradoxo da calcificação das placas com a baixa densidade óssea e também com a presença, no vaso, de várias proteínas associadas à remodelação óssea, como RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand), OPG (Osteoprotegerin) e colagénio tipo 1. Estudos em modelos animais têm reforçado estes dados. Ratinhos knock-out para OPG, para além de apresentarem uma osteoporose generalizada, exibiram também um aumento da calcificação ao nível vascular. Este estudo centrou-se na hipótese da existência de mecanismos fisiopatológicos comuns aos dois sistemas. Pretendemos avaliar ao longo do tempo, utilizando um modelo animal (ApoE -/-) que é geneticamente propenso ao desenvolvimento de aterosclerose (por delecção do gene da apolipoproteína E), o efeito da inflamação sobre os ossos e os vasos. Os objectivos deste trabalho foram a avaliação dos níveis séricos de CTX-I (C-terminal cross-link telopeptide of type I collagen) e P1NP (N-propeptide of type I collagen), duas proteínas resultantes do processo de turnover ósseo (marcadores de reabsorção e de formação óssea, respectivamente), como também a microarquitectura óssea das vértebras lombares por histomorfometria, para compreender possíveis efeitos ao nível do osso trabecular. Pretendemos ainda avaliar a progressão das lesões ateroscleróticas e avaliar a relação entre a aorta e o osso pela determinação dos níveis de expressão de genes associados com a inflamação (interleucina (IL-) 1β; IL-6; IL-17A e TNF (Tumor Necrosis Factor)) e com a remodelação óssea (RANKL e OPG). Adicionalmente, como objectivo secundário deste estudo, pretendeu-se avaliar as variações no osso e no vaso, especialmente o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas ao nível da aorta, num modelo animal inflamatório (K/BxAg7), que desenvolve uma artrite espontânea (com consequente desenvolvimento de uma osteoporose secundária) e que foi descrito como estando predisposto para o desenvolvimento de aterosclerose. Para cumprir com os objectivos foram formados 5 grupos correspondendo aos diferentes time-points (8, 16, 20, 24 e 28 semanas de idade) para as duas estirpes de ratinhos usados (ApoE -/-, como modelo de aterosclerose, e C57BL/6, como controlo saudável), com 10 animais em cada grupo, dos quais 5 foram destinados para os testes de expressão génica (osso e aorta) e histomorfometria, e os outros 5 para avaliação das lesões na aorta. Todos os ratinhos estiveram sob uma dieta gorda desde as 10 semanas. Para o objectivo secundário foram usados ratinhos K/BxAg7 divididos em dois grupos, num foi introduzida a dieta gorda às 10 semanas de idade (N=4) e noutro manteve-se com a dieta normal durante toda a experiência (N=5). Estes animais foram avaliados às 24 semanas de idade, com doseamento dos níveis séricos de CTX-I e P1NP, avaliação da expressão génica (osso e aorta) e da presença de lesões na aorta. A todos os animais, no momento da eutanásia foi recolhido sangue por punção cardíaca e posteriormente centrifugado para a obtenção do plasma. Após perfusão, as aortas foram recolhidas e conservadas em PBS (até serem congeladas com azoto líquido para posteriormente se proceder à extração de RNA) ou em paraformaldeído para a quantificação das lesões por marcação dos lípidos com Oil Red O. Foram ainda recolhidos e imediatamente congelados diversos ossos, incluindo um fémur (após remoção da medula) para extracção de RNA e as vértebras lombares para a histomorfometria. Os níveis séricos de CTX-I e P1NP foram determinados por ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e as vértebras lombares (L3-L4) foram analisadas por histomorfometria para a determinação do volume de osso trabecular, espessura trabecular e também a separação entre trabéculas. Os fémures e aortas destinados à extração de RNA foram reduzidos a um pó fino, a extração foi efectuada com TRIzol®/clorofórmio e posteriormente foi realizada a síntese de cDNA para a análise da expressão génica utilizando SYBR®Green e primers desenhados especificamente para cada gene a avaliar. A quantificação foi feita por PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitativo em tempo real e na análise final todos os genes foram normalizados para o rRNA 18S utilizado como housekeeping gene (gene de referência). Todos os animais utilizados neste estudo foram avaliados semanalmente e o seu peso registado. Adicionalmente, ao modelo de artrite, e como forma de avaliar a progressão da doença, foi aplicado um score clínico avaliado pela observação semanal dos animais. Pela avaliação dos dados histomorfométricos e dos níveis séricos dos marcadores de remodelação óssea verifica-se uma concordância entre os resultados obtidos, com uma diminuição significativa no volume ósseo, na espessura trabecular e níveis de P1NP ao longo do tempo, e um aumento na separação inter-trabecular e nos níveis séricos de CTX –I, sugerindo que ambos os grupos experimentais foram sofrendo de uma perda de massa óssea, com especial ênfase no grupo ApoE -/-, onde se verificaram algumas diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo B6. Os resultados obtidos na expressão génica mostraram algumas diferenças estatisticamente significativas entre B6 e ApoE -/-, contudo, de uma maneira geral, foi o grupo dos ratinhos B6 que apresentou maiores níveis de expressão das citocinas, tanto na aorta como no osso. Não se encontrou uma associação com significância estatística na correlação da expressão das citocinas entre os dois tecidos. No entanto verificámos a existência de uma relação entre IL-1β e IL-6, e entre TNF e OPG no osso dos ApoE -/- às 16 semanas e no grupo dos B6 às 28 semanas apenas entre TNF e OPG, mas estas correlações foram pontuais, cingindo-se a apenas um ponto de avaliação, e não se verificou a continuidade destas correlações nos time-points seguintes. A falta de um forte suporte estatístico nestes resultados pode dever-se ao facto de a expressão dos genes avaliados, principalmente na aorta, apresentar valores muito dispersos, além de serem muito diferentes dos valores obtidos no osso. Esta discrepância poderá dever-se ao facto de a aorta ser um tecido menos robusto e que poderá estar mais susceptível à degradação do RNA durante o processamento da amostra. Procedeu-se posteriormente à comparação dos dados obtidos nas diversas análises efectuadas, medição de marcadores séricos, histomorfometria e expressão génica. Observou-se uma correlação negativa entre a espessura trabecular e os níveis de expressão da OPG no osso dos ratinhos ApoE -/- com 16 semanas, e também entre o volume ósseo e a separação trabecular no grupo B6 às 28 semanas, mas mais uma vez estas correlações foram pontuais, sem grande significado biológico. Estes resultados estão de acordo com o esperado face aos dados epidemiológicos e de estudos em modelo animal que reforçam a associação entre a progressão da aterosclerose e a perda de massa óssea com possível desenvolvimento de uma osteoporose. Contudo os dados de expressão génica não apoiam esta conclusão (chegando a ser discordantes), apesar de existirem alguns estudos com este modelo animal que reportam um aumento da formação óssea em ratinhos ApoE -/-, pelo que os dados com este modelo são ainda um pouco contraditórios. É importante ter em conta que o grupo controlo (B6) estava também sujeito a dieta gorda, uma vez que esta dieta potencia e acelera o desenvolvimento das lesões ateroscleróticas nos ratinhos ApoE -/-. A dieta gorda foi introduzida em ambos os grupos, a fim de uniformizar qualquer alteração introduzida pela dieta, pois um estudo prévio de Hirasawa et al. reportou que a dieta gorda induz uma redução da mineralização óssea. No entanto face aos resultados obtidos, este trabalho poderia beneficiar de uma análise dos parâmetros estudados, num grupo controlo (B6) sem dieta gorda de forma a verificar os níveis normais de todas as proteínas estudadas. Quanto ao objectivo secundário e ao modelo de inflamação (K/BxAg7), não foram encontradas lesões ateroscleróticas visíveis na aorta, contrariamente ao que foi repo
Author: Renata I. Casimiro
Language: English
Subfield: Immunology
Field: Immunology and Microbiology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2210205788