Indicadores de cálcio e de voltagem codificados geneticamente na detecção de potenciais de ação e inputs sinápticos em cultura de neurônios hipocampais
Year: 2013
Type: dissertation
Abstract: Neurônios se comunicam por meio de sinapses, trocando mensagens capazes de modificar o\npotencial de membrana de outros neurônios. Demonstrar o papel desses sinais e decodificar\nessa linguagem elétrica representa o grande objetivo da neurociência moderna. Atualmente, a\neletrofisiologia é o ramo da neurociência capaz de investigar esses recursos elétricos de\nneurônios - que vão desde registros de condutância e comportamento cinético de canais\niônicos individuais até a demonstração de neurônios individuais implicados em\ncomportamentos complexos. Nesse sentido, diferentes estados cerebrais e comportamentos\nimplicam o recrutamento de grandes conjuntos de neurônios se comunicando em um estado\ncoerente, dinâmico. Além disso, essas grandes populações são formadas por diversos\nsubtipos neuronais cuja análise requer ténicas que possibilitem uma resolução temporal e\nespacial de células individuais e, prefencialmente, de subtipos específicos. Apenas\nrecentemente, indicadores ópticos geneticamente codificados surgiram como ferramentas não\ninvasivas de alta resolução espacial e temporal utilizados para monitorar a atividade de\nneurônios individuais e populações neuronais específicas. O número crescente de novos\nindicadores optogenéticos, juntamente com a ausência de comparações em condições\nidênticas, gerou dificuldade em escolher a mais adequada das proteínas, dependendo do\ndesenho experimental. Portanto, o objetivo deste estudo foi comparar três proteínas repórter\nrecentemente desenvolvidas: os indicadores de cálcio GCaMP3 e R-GECO1, e o indicador de\nvoltagem VSFP butterfly1.2. Foram expressos em neurônios do hipocampo em cultura, os\nquais foram submetidos a registros de patch-clamp e de imageamento óptico. Os três grupos\n(cada um expressando uma proteína) exibiram valores semelhantes de potencial de membrana\n(em mV, GCaMP3: -56 ± 8,0; R-GECO1: -57 ± 2,5; VSFP: -60 ± 3,9; p = 0,86), no entanto,\no grupo de neurônios que expressam VSFP mostrou uma média mais baixa de resistência de\nentrada do que os outros grupos (em Mohms, GCaMP3: 161 ± 18,3; GECO1-R: 128 ± 15,3;\nVSFP: 94 ± 14,0; p = 0,02). Cada neurônio foi submetido a injeções de correntes com\nfrequências diferentes (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1,5 Hz, e 0,7 Hz) e as suas respostas de\nfluorescência foram registradas. Em nosso estudo, apenas 26,7% (4/15) dos neurônios que\nexpressam VSFP mostraram sinal de fluorescência detectável em resposta a potenciais de\nação. O valor médio de sinal-para-ruído (SNR), obtido em resposta a cinco potenciais de aҫão\n(a 10 Hz) foi pequeno (1,3 ± 0,21), no entanto a cinética rápida do VSFP permite a\ndiscriminação de disparos, como picos individuais, com detecção de 53% dos APs evocados.\nFreqüências abaixo de 5 Hz, assim como variaҫões no potencial de membrana subliminares,\nforam indetectáveis devido ao alto ruído do sinal de fluorescência. Por outro lado, os\nindicadores de cálcio mostraram maior alteração na fluorescência, seguindo o mesmo\nprotocolo (cinco potenciais de aҫão a 10 Hz). Entre os neurônios expressando GCaMP3, 80%\n(8/10) exibiram sinal, com um valor médio de SNR de 21 ± 6,69 (soma), enquanto que para\nos neurônios expressando R-GECO1, 50% (2/4) dos neurônios demonstraram sinal com um\nvalor médio SNR de 52 ± 19,7 (soma). Para protocolos de 10 Hz, 54% dos disparos foram\ndetectados com evocado GCaMP3 e 85% com o R-GECO1. Disparos foram detectados em\ntodas as frequências e os sinais de fluorescência foram também detectados a partir de\ndespolarizações subliminares. Sendo GCaMP3 o indicador mais provável de produzir sinal de\nfluorescência e com alto SNR, alguns experimentos foram realizados somente com essa\nproteína. Observamos que GCaMP3 é eficaz na detecção de inputs sinápticas (envolvendo\ninfluxo de Ca2+), com alta resolução espacial e temporal. Também foram observadas\ndiferenças entre os valores de SNR resultantes dos disparos evocados, em comparação com\nos disparos espontâneos. Em registros de grupos de células, GCaMP3 mostrou clara\ndiscriminação entre células ativadas e silêncio, revelando-se como uma ferramenta potencial\nem estudos de sincronização neuronal. Assim, nossos resultados sugerem que os indicadores\nde cálcio disponíveis atualmente permitem estudos detalhados sobre a comunicação neuronal,\nque vão desde dendritos individuais até a investigação de eventos de sincronia em redes\nneuronais geneticamente definidas. Em contraste, VSFPs representam uma tecnologia\npromissora para monitorar a atividade neural e, apesar de ainda requererem melhoramentos,\npodem se tornar mais apropriados do que os indicadores de cálcio, uma vez que os neurônios\ntrabalham em uma escala de tempo mais rápida do que eventos de cálcio podem prever
Author: Hermany Munguba Vieira
Language: Portuguese
Subfield: Biophysics
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2231528360