Year: 2009
Type: dissertation
Abstract: Die humanen Elongationsfaktoren negative elongation factor (NELF) und 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) sind Schlusselfaktoren beim promotorproximalen Arretieren in der fruhen Elongationsphase der Transkription. Dabei interagieren beide Faktoren direkt mit RNA-Polymerase II. NELF bindet uber die RNA recognition motif (RRM)-Domane der Untereinheit E zusatzlich an die naszierende RNA. Eine derartige Transkriptionsblockade tritt auch wahrend der Transkription des Genoms des humanen Immunschwachevirus 1 (HIV-1) Provirus auf. NELF bindet hierbei an die Haarnadel-Struktur der naszierenden RNA (HIV-1 TAR RNA). Ein Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Analyse der RRM-Domane von NELF E sowie die Untersuchung einer moglichen sequenzspezifischen Bindung von NELF E RRM an HIV-1 TAR RNA. Auserdem galt es, die Struktur der kleinen Untereinheit von DSIF, hSpt4, zu bestimmen und ihre Interaktion mit der NGN-Domane der grosen DSIF-Untereinheit hSpt5 naher zu charakterisieren. Die Struktur der RRM-Domane von NELF E wurde mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) bestimmt (PDB: 2BZ2) und besteht aus einem vierstrangigen Faltblatt mit zwei alpha-Helices, die gegen eine Seite des Faltblattes packen. An der RNA-Bindung sind die zentralen beta-Strange mit den beiden aromatischen Resten Tyr43 und Phe77 aus dem Konsensussequenzmotiv ribonucleoprotein domain 2 (RNP2) bzw. RNP1 involviert. Der in der freien Form unstrukturierte C-Terminus der RRM bildet in der gebundenen Form (PDB: 2JX2) eine 3-10-Helix aus, die hochstwahrscheinlich direkt an der RNA-Bindung beteiligt ist. RRM-Domanen gelten als klassische einzelstrangbindende Domanen. Die prognostizierte Bindestelle von NELF E ist jedoch die doppelstrangige HIV-1 TAR RNA Stammregion. Die durchgefuhrten 15N-NMR-Titrationsexperimente und Fluoreszenzgleichgewichtstitrationen mit die HIV-1 TAR RNA umfassenden RNA Oligonukleotiden zeigten, dass NELF E RRM praferentiell einzelstrangige RNA bindet. Die ermittelten KD-Werte lagen dabei alle im niederen mikromolekularen Bereich. NELF E RRM zeigt somit im Vergleich zu anderen RRM-Domanen eine schwachere Affinitat fur RNA. Eine sequenzspezifische Bindung an die HIV-1 TAR RNA konnte, auch in Versuchen mit der gesamten NELF E Untereinheit, nicht beobachtet werden. Vieles deutet somit darauf hin, dass RNA-Bindung durch NELF E sequenzunabhangig stattfindet. Der Zeitpunkt der RNA-Bindung wahrend der Elongation der Transkription wird womoglich durch andere Faktoren bzw. Ereignisse gesteuert. NELF ubt seine inhibitorische Wirkung nur im Zusammenspiel mit dem Elongationsfaktor DSIF aus, uber den es nur wenig strukturelle Informationen gibt. Die Koexpression von hSpt4 mit der NusG N-terminalen Homologie Domane von hSpt5 (hSpt5-NGN) als dessen Interaktionspartner ermoglichte die Bestimmung der Kristallstruktur von hSpt4/hSpt5-NGN bis zu einer Auflosung von 1.55 A (PDB: 3H7H). hSpt5-NGN besteht aus einem zentralen, vierstrangigen Faltblatt und aus einzelnen Helices, die von beiden Seiten gegen das Faltblatt…
Author: Sabine Wenzel
Language: German
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2254483570