Year: 2010
Type: dissertation
Abstract: O aumento da tuberculose multirresistente e extensivamente resistente (TBMR e TBXDR) gerou um agravamento das preocupações por parte das autoridades de Saúde Pública em todo o mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) define TBMR como tuberculose (TB) resistente pelo menos à isoniazida e à rifampicina, os principais fármacos de primeira-linha utilizados no tratamento da TB, enquanto que a TBXDR refere-se a casos de TB resistente não só à isoniazida e à rifampicina, mas também a uma fluoroquinolona e a pelo menos a um dos três fármacos de segunda-linha injectáveis canamicina, amicacina e capreomicina. A resistência em Mycobacterium tuberculosis deve-se principalmente à ocorrência de mutações espontâneas, à qual se segue a selecção de mutantes resistentes durante o tratamento. No entanto, algumas estirpes clínicas de M. tuberculosis resistentes não apresentam mutação em qualquer um dos genes que se sabe estarem associados à aquisição de resistência a um determinado fármaco, o que sugere que outro(s) mecanismo(s) deverão estar envolvidos no desenvolvimento de resistência, nomeadamente a presença de sistemas de bombas de efluxo que efectuam a extrusão do composto para o exterior da célula, evitando que o mesmo atinja o seu alvo. Um aumento da actividade de efluxo pode ocorrer devido a uma exposição prolongada a concentrações subinibitórias dos antibacilares, uma situação que pode resultar de uma terapia inadequada. A inibição da actividade de efluxo com um inibidor que não seja um antibiótico poderá restaurar a actividade de um antibiótico que seja substrato de bombas de efluxo e desta forma consistir uma forma de aumentar a actividade dos actuais fármacos utilizados no tratamento da TB. O trabalho descrito nesta dissertação tem como objectivo o estudo dos mecanismos de efluxo no desenvolvimento de multirresistência em M. tuberculosis e de como a resistência fenotípica mediada por bombas de efluxo se correlaciona com a resistência genética. De forma a alcançar este objectivo, foram desenvolvidos vários protocolos experimentais utilizando modelos biológicos, tais como Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis uma micobactéria de crescimento rápido e Mycobacterium avium, antes da sua aplicação ao estudo de M. tuberculosis. Esta abordagem permitiu o estudo dos mecanismos que resultam na adaptação fisiológica de E. coli à tetraciclina por exposição a concentrações subinibitórias deste antibiótico (Capítulo II), o desenvolvimento de um método fluorimétrico que permite a detecção e quantificação da actividade de efluxo (Capítulo III), a caracterização do transporte de brometo de etídeo em M. smegmatis (Capítulo IV) e a contribuição da actividade de efluxo para a resistência aos macrólidos no complexo Mycobacterium avium (Capítulo V). Por fim, os métodos desenvolvidos permitiram o estudo do papel das bombas de efluxo em estirpes de M. tuberculosis induzidas a resistência à isoniazida. Assim, como descrito no Capítulo II, foi possível observar que a adaptação fisiológica de E. coli à presença de tetraciclina resulta de uma interacção entre mecanismos a nível genético e modificações pós-traducionais a nível da conformação de proteínas que diminui a permeabilidade da parede celular e aumenta a actividade das bombas de efluxo. Para além disso, o Capítulo III descreve o desenvolvimento de um método fluorimétrico semi-automático que permitiu correlacionar esta actividade de fluxo com a cinética de transporte do brometo de etídeo (um conhecido substrato de bombas de efluxo) em E. coli e também a identificação de inibidores do efluxo. Relativamente a M. smegmatis, comparou-se a estirpe selvagem M. smegmatismc2155 com mutantes "knockout" para LfrA e MspA, no que respeita à sua capacidade de transportar brometo de etídeo. Os resultados apresentados no Capítulo IV demonstraram que MspA, a principal porina de M. smegmatis, desempenha um papel importante na entrada de brometo de etídeo e antibióticos na célula e que o efluxo através da bomba LfrA está envolvido na resistência de baixo nível a estes compostos em M. smegmatis. O Capítulo V descreve o estudo da contribuição de bombas de efluxo na resistência aos macrólidos em estirpes clínicas do complexo M. avium. Demonstrou-se que a resistência à claritromicina sofreu uma redução significativa na presença dos inibidores de efluxo tioridazina, clorpromazina e verapamil. Estes inibidores também diminuíram o efluxo de brometo de etideo e aumentaram a retenção de eritromicina marcada com 14C nestas estirpes. Por fim, os métodos desenvolvidos com os modelos experimentais referidos acima permitiram o estudo do papel das bombas de efluxo em estirpes de M. tuberculosisinduzidas à resistência à isoniazida. Este trabalho encontra-se descrito no Capítulo VI desta dissertação, onde se demonstra que a indução de resistência à isoniazida não resultou da ocorrência de mutações em qualquer um dos genes associados com a resistência a este fármaco, mas de um sistema de efluxo que é sensível a inibidores do efluxo. Estes inibidores provocaram a diminuição do efluxo de brometo de etídeo e também a redução da concentração mínima inibitória da isoniazida nestas estirpes. Para além disso, a análise de expressão genética demonstrou a sobre-expressão de genes que codificam para bombas de efluxo nas estirpes induzidas comparativamente com as estirpes originais não induzidas. Concluindo, o trabalho descrito nesta dissertação demonstra que as bombas de efluxo desempenham um papel importante no desenvolvimento de resistência, em particular nas micobactérias. Uma estratégia para ultrapassar a resistência mediada por mecanismos de efluxo poderia passar pela utilização de compostos que inibem a actividade de efluxo, restaurando a actividade de antimicrobianos que são substratos de bombas de efluxo, uma abordagem útil particularmente em TB em que os regimes de tratamento mais eficazes se estão a tornar ineficazes face ao aumento da TBMR/TBXR.
Author: Liliana Rodrigues
Language: English
Subfield: Infectious Diseases
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2271598234