Estudio de la expresión del gen CISD1 mediada por la actividad del CFTR
Year: 2010
Type: dissertation
Abstract: La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesivaproducida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Muy poco se sabe sobre los mecanismos moleculares involucrados en el dañocelular producido por la falla del canal CFTR. Mediante la metodología de “Display Diferencial” o “Differential Display” (DD) observamos que la expresióndel gen de origen nuclear CISD1 (CDGSH Iron Sulfur Domain 1) estabadisminuída en un modelo celular de FQ. Dado que el DD es una técnica queaporta evidencias pero es susceptible a falsos positivos y negativos, se decidióque el primer enfoque de esta Tesis fuera corroborar los resultados del DD. Para ello se utilizaron técnicas como RT-PCR semi cuantitativas y RT seguidade PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión de CISD1 endistintos modelos celulares de FQ o con células que expresasen CFTR wt enpresencia de inhibidores o activadores del CFTR. Ya que CISD1 es un genque se encuentra en el genoma nuclear, el siguiente enfoque de esta Tesis fuedeterminar la localización subcelular de su producto. En este caso, se utilizó laexpresión de una quimera unida a EGFP y mediante microscopía confocalpudimos demostrar que CISD1 codifica una proteína de localizaciónmitocondrial. La localización mitocondrial fue confirmada por Wiley y col. Ellosademás reportaron que CISD1 posee un grupo prostético del tipo 2Fe-2S enlugar de Zinc, como postulamos en un principio debido a su estructura primaria. La función de esta proteína es desconocida, pero estudios hechos enmitocondrias aisladas de células cardíacas de un ratón nulo (-/-) paramitoNEET (CISD1 en humanos) presentaban disminuída en un 30 % lacapacidad máxima de la fosforilación oxidativa medida en estado 3. Además,en un trabajo anterior de Colca y colaboradores, se reportó que la proteína Minner-1 de ratón (producto de splicing alternativo de CISD1) co-inmuno precipitó con proteínas pertenecientes al complejo l de la cadena de transportede electrones. Luego de que comprobamos su localización mitocondrial mediante laquimera GFP-CISD1, nuestro siguiente objetivo fue determinar si la actividaddel complejo I mitocondrial se encontraba afectada por la expresión diferencialde CISD1 (un efecto observado en FQ por Grabriel Valdivieso en su Tesis, aúnno publicado). Para tal fin medimos la actividad in gel del CIm mediante latécnica “Blue Native-PAGE” (BN-PAGE), en mitocondrias extraídas desdediferentes modelos experimentales de células FQ transfectadas con CISD1salvaje y células Caco-2 (no FQ) transfectadas con un variante mutada de CISD1 obtenida por mutagénesis dirigida en las cisteínas 72 y 74 que fueronreemplazadas por serinas en un plásmido de expresión para eucariotas pcDNA 3.1(-). Así, observamos que la disminución significativa de la actividad del CImreportada por Valdivieso y col. en distintos modelos FQ era restaurada por laexpresión ectópica de CISD1, mientras que la variante mutada de CISD1moduló negativamente la actividad normal del Clm en células Caco-2 (no FQ).
Author: G. Taminelli
Institution: Universidad de Buenos Aires
Language: Spanish
Subfield: Pulmonary and Respiratory Medicine
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2275558208