Year: 2007
Type: dissertation
Abstract: Sammendrag\nBakgrunn: Vinkristin (VCR) er et kjemoterapeutikum som benyttes i behandling av blant annet Hodgkin lymfom (HL) og non-Hodgkin lymfom (NHL). Perifer nevropati er dosebegrensende for VCR-terapi, og årsak til at flere pasienter må seponere behandling. VCR metaboliseres til den antatte hovedmetabolitten M1 via cytokrom P450 3A (CYP3A), og da spesielt av det genetisk polymorfe enzymet CYP3A5. Transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), som blant annet er uttrykt i blod-hjernebarrieren, galle og lever, er også observert å bidra til eliminasjon av VCR. Varierende utrykk av CYP3A5 og P-gp er mistenkt å bidra til den store intraindividuelle variasjonen som er observert i eliminasjon av VCR. Rikshospitalet-Radiumhospitalet HF har initiert VINCA-studien for å se på sammenhengen mellom plasmakonsentrasjon av VCR og perifer nevropati hos pasienter diagnostisert med HL og NHL. Hensikten med denne oppgaven er å utvikle en sensitiv og robust metode for deteksjon av VCR og M1 i plasma, som skal benyttes til farmakokinetiske målinger i VINCA-studien.\n \nMetodeutvikling: M1 finnes ikke kommersielt tilgjengelig som renstoff, og måtte produseres preparativt. Det ble benyttet mikrosomer fra insektceller ko-transfektert med CYP3A5 og cytokrom b5 for å produsere M1 fra VCR. En LC-UV-metode med vinblastin som intern standard (IS) ble utviklet for analyse av metabolismeforsøkene og preparativ isolering av M1. LC-UV-metoden var ikke sensitiv nok for kvantitative analyser av pasientprøver etter administrasjon av VCR i terapeutiske doser. Det ble derfor utviklet en LC-MS-metode med utgangspunkt i de kromatografiske betingelsene utviklet på LC-UV. MS-deteksjonen ble foretatt med elektrospray-ionisasjon i positiv mode. For å oppnå tilstrekkelig lav deteksjonsgrense på LC-MS-analyse ble det testet ut prosedyrer for oppkonsentrering av plasmaprøver ved fast fase-ekstraksjon. I denne uttestingen ble ulike fast fase-kolonner evaluert (C2, C18, Oasis HLB og Strata-X).\n\nResultat og diskusjon: Den isolerte mengden av M1 ble kvantifisert til å være 1,05 g/ml. Produktet viste seg å være rent, men utbyttet av metabolitten ble lavere enn forventet. For grunnlinjeseparasjon av VCR, IS og M1 ved LC-UV-analyser ble det utviklet en mobilfasegradient med maksimal stigning på 0,77 % MeOH/min. I LC-MS-metoden ble mobilfasegradienten (maksimalt 10 % MeOH/min) og mobilfasehastigheten (0,15 ml/min) optimalisert for å oppnå rask analyse og lavest mulig deteksjonsgrense. VCR forekommer i plasmakonsentrasjoner i området 0,1-2,5 ng/ml, som er for lave for deteksjon på den utviklede LC-MS-metoden uten oppkonsentrering. I uttestingen av fast fase-prosedyre for oppkonsentrering av plasmaprøver viste C18-kolonner best resultat. Plasma ble oppkonsentrert med en faktor 6-7 med fast fase-ekstraksjoner på C18-kolonner og gjenfinningen var god ved høy konsentrasjon av VCR (80 %). I det lavere konsentrasjonsområdet ble imidlertid gjenfinningen svært dårlig. Dette kan skyldes signalsuppresjon av plasmakomponenter ved MS-deteksjon. For å unngå problemer med signalsuppresjon kan det forsøkes en grundigere vaskeprosess som fjerner flest mulig plasmakomponenter i fast fase-opparbeidelsen. I tillegg kan kjemisk ionisasjon (AP-CI) testes som deteksjonsprisnipp i MS-analysen for å begrense signalsuppresjon. Endring fra elektrospray-ionisasjon til AP-CI kan også være et tiltak for å forbedre sensitiviteten i deteksjon av VCR på LC-MS.\n\nKonklusjon: Det ble utviklet en LC-UV-metode som ble benyttet til isolering av M1 fra metabolismeforsøk med VCR, men metoden var ikke sensitiv nok for kvantitative analyser av VCR og M1 i plasmaprøver. En LC-MS-metode ble videreutviklet for å oppnå bedre sensitivitet. Med oppkonsentrering av plasmaprøvene med fast fase-ekstraksjon bør den utviklede LC-MS-metoden gi god nok deteksjon, men det er nødvendig med ytterligere uttesting før analysemetoden kan valideres og anvendes på prøvene fra VINCA-studien.
Author: Stine Hiller Eidnes
Language: Norwegian
Subfield: Pharmacology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2282926083