Utvikling og testing av Multiple-locus variable-number (MLVA) tandem repeat analysemetode for Shigella sp.
Year: 2007
Type: dissertation
Abstract: Shigella er den vanligste årsaken til dysenteri, og rammer særlig barn i u-land. Årlig dør ca. 165 millioner mennesker av sykdom forårsaket av Shigella. Av de fire Shigella artene Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri og Shigella sonnei er S. flexneri er den hyppigst forekommende i u-land. S. sonnei er den vanligste i i-land og smitte skjer typisk ved internasjonal reise eller av kontaminerte matvarer. Genotyping av bakterier med epidemisk potensial er vanlig, og i denne oppgaven ble det utviklet en PCR basert metode for å type Shigella sp. Metoden er ”multiple-locus variable number tandem repeat analysis” (MLVA). For MLVA utnyttes bestemte hypervariable områder på genomet som består av repetisjonenheter etter hverandre. Disse repeterte områdene kalles ”variable number of tandem repeat” (VNTR) loci. Antall repetisjonsenheter på et locus varierer som oftest mellom ulike bakteriestammer og er en veldokumentert stammedefinerende parameter. MLVA gjør det mulig å identifisere og spore ulike stammer av Shigella sp. ved sykdomsutbrudd av bakterien. \n\nÅtte ulike Shigella primeresett ble prøvd ut parvis på 20 bakterier for å undersøke om de ga PCR produkt. Syv av disse primerparene ga PCR produkt og ble merket med tre ulike fluorescerende farger. De syv ulike primersettene ble blandet i en reaksjon til en PCR multipleks, som ble utprøvd på 50 bakterier og analysert på kapillærelektroforese (ABI 310). Et av de syv primersettene ble forkastet etter disse 50 analysene, da PCR produktene til dette primersettet ikke var polymorfe nok. Med PCR multipleksen bestående av seks primersett ble ca. 130 flere bakterier typet. For å undersøke metodens reproduserbarhet ble ca. 10 % av alle typede bakterier analysert på nytt. Stabilitetsundersøkelser av VNTR loci ble også gjort ved å omså fire Shigella bakterier ca. 75 ganger. \n\nLocusdiversiteten (D) viste særlig gode differensierende resultater for ett primersett (SHTR4) med D-verdi på 0,91 for Shigella sp. SHTR4 viste en svært god D-verdi på 0,88 for S. dysenteriae, men de andre primerene hadde ikke like gode D-verdier for denne arten. Det bør derfor jobbes videre for å finne flere primere som kan bidra til bedre diversitet i denne arten. Totalt sett av Shigella sp. var de beste D verdiene for S. sonnei, med tre ulike primersett som ga D-verdiene 0,94, 0,89 og 0,87. Både stabilitetstesten og reproduserbarhetsundersøkelsen viste utmerket stabilitet og reproduserbarhet. Generelt sett viste dendrogrammet meget god separasjon av S. sonnei og S. flexneri, dette er nyttig ettersom disse artene er de hyppigst forekommende i verden. S. sonnei ble separert ut i en egen gren, det vil si at denne arten virker homogen og denne observasjonen samsvarer med tidligere studier.
Author: Monica Rawal
Language: Norwegian
Subfield: Microbiology
Field: Immunology and Microbiology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2285449492