In vitro and in vivo activities of lactic acid bacteria from Italian mountain cheese" and their exploitation in dairy production
Year: 2016
Type: dissertation
Abstract: I batteri lattici che possiedono proprietà salutistiche, oltre a poter essere introdotti come colture starter o colture aggiunte durante la produzione di prodotti caseari, potrebbero essere utilizzati per facilitare la biosintesi in situ di molecole bioattive durante il processo di fermentazione, aumentando l’interesse nei confronti dei prodotti caseari come alimenti multifunzionali. Ultimamente, i formaggi a latte crudo sono grande oggetto di ricerca in quanto nicchie di elevata biodiversità; in seguito alla caratterizazione genotipica e tecnologica del microbiota autoctono è possibile selezionare ceppi che potrebbero essere utilizzati per migliorare il profilo sensoriale del formaggio e dare al prodotto un valore aggiunto di tipo salutistico. Il formaggio Tradizionale di Montagna (TM) viene prodotto da latte crudo di vacca e il processo di fermentazione avviene spontaneamente in piccole fattorie chiamate “Malghe”, collocate nelle aree alpine della regione Trentino. Per la prima volta, la popolazione microbica del formaggio TM è stata caratterizzata con l’obiettivo di selezionare cocchi e batteri lattici appartenenti al gruppo dei non-starter (NSLAB) che, rispettivamente, potessero essere utili per lo sviluppo di nuove colture starter o colture aggiunte. Sono state effettuate le conte microbiologiche di campioni (n=120) di latte, cagliata e formaggio a diversi tempi di stagionatura (24 ore, 1 mese e 7 mesi) su terreni di coltura selettivi. I cocchi mesofili e termofili sono risultati dominanti nelle 24 ore successive alla produzione, mentre i lattobacilli mesofili hanno mostrato la concentrazione microbica più elevata a fine stagionatura. Seicentoquaranta colonie sono state isolate da campioni di cagliata e formaggio a 24 ore e altre 95 colonie sono state isolate da campioni di formaggio a 7 mesi di stagionatura. Tutti gli isolati sono stati caratterizzati genotipicamente utilizzando la tecnica RAPD- PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction) servendosi di due primers, PCR specie-specifica e sequenziamento parziale del gene 16S rRNA. I cocchi, appartenenti a 16 specie diverse, sono stati raggruppati \nin 231 biotipi, mentre i NSLAB sono stati raggruppati in 70 biotipi e attribuiti a 13 specie diverse. Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus e Enterococcus faecalis erano le specie dominanti nei campioni di cagliata e formaggio a 24 ore; Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus paracasei erano le specie principali a fine stagionatura. \nSono state testate le caratteristiche fenotipiche, tecnologiche e salutistiche di tutti i ceppi; in particolare, lattococchi, streptococchi ed enterococchi sono stati analizzati per la loro attività acidificante e proteolitica, capacità di crescere a temperature non ottimali, produzione di acetoino, produzione di note olfattive, capacità di inibire la crescita dei coliformi autoctoni del latte e il tasso di autolisi. Il 40% degli enterococchi ha mostrato la capacità di inibire in vitro la crescita dei coliformi del latte, ma sono stati esclusi come possibili ceppi starter perchè presentavano fattori di rischio. Tra i lattococchi e gli streptococchi, 4 Lc. lactis subsp. lactis e 2 Sc. thermophilus, caratterizzati da una rapida attività acidificante e note sensoriali gradevoli, sono stati sottoposti ad un test di resistenza alla liofilizzazione. I ceppi Lc. lactis subsp. lactis 68 e Sc. thermophilus 93 hanno mostrato le proprietà migliori e, quindi, potrebbero essere adatti per la produzione di formaggi. \nI ceppi NSLAB sono stati testati per le loro proprietà di crescita, metabolismo dei carboidrati, attività acidificante, proteolitica e lipolitica, produzione di acetoino, attività amino peptidasica (AP) e produzione di amine biogene. Per quanto riguarda le proprietà salutistiche, l’attività di idrolisi dei sali biliari (BSH) è stata testata qualitativamente, la produzione di acidi linoleici coniugati è stata misurata spettrofotometricamente e la produzione di acido γ- aminobutirrico (GABA) è stata quantificata tramite UHPLC. Gli isolati appartenenti alla specie Lb. paracasei hanno dimostrato di essersi ben adattati all’ambiente di Malga e hanno mostrato la migliore attività AP e produzione di acetoino. Alcuni ceppi hanno mostrato proprietà salutistiche molto interessanti e hanno prodotto sostanze bioattive. In particolare, Lb. rhamnosus BT68, Lb. paracasei BT18, BT25, BT31 e Pc. pentosaceus BT3, BT13, BT51 hanno prodotto tra 70 e 130 mg/mL di CLA totali in vitro. Lb. brevis BT66 ha convertito l’acido L-glutamico in elevate concentrazioni di GABA (129 ± 8.6 mg/L) e ha \nmostrato attività BSH. Questi primi risultati hanno dimostrato che il formaggio TM è una riserva di elavata diversità microbica e che i batteri lattici autoctoni potrebbero essere utilizzati non solo per la produzione di prodotti caseari ma anche per le loro proprietà salutistiche. \nLc. lactis subsp. lactis 68 e Sc. thermophilus 93, considerati come i ceppi autoctoni migliori, sono stati testati come colture starter per la produzione di 9 forme di formaggio TM direttamente in Malga. Tre formaggi controllo (CTRL) sono stati prodotti secondo la tradizione e senza l’aggiunta di starter o colture aggiunte, mentre tre formaggi con ceppi starter autoctoni (STR) e tre formaggi con un ceppo starter commerciale (CMS) sono stati prodotti inoculando rispettivamente nel latte di caldaia i due ceppi selezionati e un ceppo commerciale appartenente alla specie Sc. thermophilus. Dopo 24 ore, 1 mese e 7 mesi di stagionatura, è stato analizzato il contenuto microbico di tutti i formaggi sperimentali. I cocchi mesofili e i lattobacilli sono risultati dominanti nei campioni di formaggio dopo 24 ore e 1 mese di stagionatura, mentre i cocchi erano predominanti nel formaggio a fine stagionatura. Il DNA genomico totale è stato estratto e un frammento della regione V1-V3 è stato amplificato e sottoposto a pirosequenziamento-454. I lattococchi e gli streptococchi erano la specie maggiormente presenti nei formaggi CTRL e STR, e il ceppo Lc. lactis ssp. lactis 68 ha influenzato la crescita dei batteri lattici autoctoni del latte crudo appartenenti alla specie Lc. lactis ssp. cremoris durante le prime fasi di fermentazione. Inoltre, il ceppo commerciale Sc. thermophilus sembra aver predominato sui batteri della specie Lc. lactis supsp. lactis e cremoris naturalmente presenti nel latte crudo e aver portato ad una riduzione di abbondanza di Lactobacillus sp. e Enterococcus sp. \nLa sopravvivenza del microbiota del formaggio TM alla digestione è stata testata in vitro simulando le condizioni gasto-intestinali (GI) umane. A fine stagionatura, i 9 formaggi sperimentali sono stati sottoposti ad un sistema modello che simula il processo digestivo nella bocca, nello stomaco e nell’intestino tenue e comprende delle fasi sequenziali di incubazione con i succhi gastrici e duodenali umani. Le conte microbiche sono state effettuate prima e dopo la simulazione: la conta batterica totale e i cocchi termofili sono diminuiti significativamente dopo \nla digestione. Trentasei lattobacilli sono stati isolati dai 9 campioni di formaggio digeriti: tra loro, 1 Lb. paracasei, 1 Lb. parabuchneri e 1 Lb. fermentum sono stati testati per la loro sopravvivenza post-transito GI. I ceppi Lc. lactis subsp. lactis 68 e Lb. parabuchneri D34 sono stati utilizzati per fermentare aliquote di latte intero che, successivamente, sono state digerite in vitro. In seguito alla simulazione della digestione, è stata registrata una riduzione maggiore (circa 1 ciclo logaritmico) della carica di Lb. parabuchneri D34 cresciuto in coltura pura piuttosto che in latte fermentato, suggerendo che Lb. parabuchneri D34 possiede la capacità intrinseca di sopravvivere alla digestione, ma il contenuto di grasso e la struttura tipici del formaggio potrebbero proteggere i batteri lattici durante il transito GI. \nInoltre, il nostro interesse nei confronti dei ceppi produttori di GABA ci ha spinti a testare la capacità del ceppo Lb. brevis BT66 di produrre GABA in situ durante la produzione di formaggio, attraverso la decarbossilazione del glutammato. Venti micro-caseificazioni sperimentali sono state effettuate utilizzando un ceppo starter commerciale (107 UFC/mL) e Lb. brevis BT66 come coltura aggiunta. Lb. brevis BT66 è stato testato in quadruplicato in quattro concentrazioni diverse (102, 103, 104, 105 UFC/mL). Con l’obiettivo di seguire l’evoluzione microbica, campioni di latte, cagliata e formaggio a 20 giorni di stagionatura sono stati processati per la conta batterica su terreni selettivi. I campioni controllo e quelli contenenti i ceppi selezionati hanno mostrato un andamento simile, suggerendo che sia i ceppi autoctoni del latte che quelli aggiunti sono cresciuti durante la stagionatura. Comunque, la carica dei lattobacilli mesofili registrata nei campioni STR e CMS era più alta dei campioni CTRL. La concentrazione di GABA e acido glutammico è stata quantificata nei campioni di formaggio a 20 giorni di stagionatura tramite UHPLC-HQOMS. I profili aminoacidici hanno mostrato che mentre la carica del ceppo Lb. brevis BT66 nel latte aumentava, la concentrazione di acido glutammico (da 324 ± 37 a 202 ± 32 mg/kg) e GABA (da 154 ± 31 a 91 ± 20 mg/kg) diminuivano significativamente nel formaggio. Questi risultati ci hanno suggerito che i ceppi sperimentali hanno convertito l’acido glutammico in GABA, ma che il GABA potrebbe essere stato successivamente convertito in succinato dall’enzima GABA- transaminasi. \nÈ stato dimostrato che l’aminoacido GABA influisce sulla funzione del cervello attraverso l’asse intestino:cervello, ha effetti positivi sul diabete e l’obesità, regola il sistema immunitario, il processo infiammatorio e il metabolismo energetico nei mammiferi, stimola l’ipotensione, ha effetti diuretici e tranquillanti. A causa della sua abilità di produrre elevate concentrazioni di GABA
Author: Ilaria Carafa
Language: English
Subfield: Food Science
Domain: Life Sciences
SDG: Zero hunger
Open Access status: green
Funder: Universiteit Antwerpen
OpenAlex ID: W2303663206