Identification and functional analysis of genes with a role in proliferation and erythroid differentiation of a chronic myelogenous leukemia cell line
Year: 2015
Type: dissertation
Abstract: La tecnica dell'RNA interference (siRNA/shRNA) rappresenta un approccio ormai consolidato per studiare il fenotipo cellulare derivante dalla perdita di funzione di un dato gene, e si presta particolarmente all'identificazione e validazione di nuovi potenziali bersagli molecolari per terapie farmacologiche mirate. Tuttavia, per linee cellulari che crescono in sospensione (per esempio, linee leucemiche), gli approcci di siRNA basati sull'uso di reagenti di trasfezione liposomiali si sono mostrati fin'ora di difficile applicazione, a causa della bassa efficienza di trasferimento degli oligonucleotidi e dell'alta sensibilità di tali modelli cellulari alle condizioni di trasfezione. E' stato perciò sviluppato un nuovo approccio metodologico di trasfezione su larga scala di librerie di oligonucleotidi siRNA, abbinato allo screening fenotipico di analisi di immagine, che permette di superare alcune delle limitazioni derivanti dall'uso di cellule che crescono in sospensione. Abbiamo identificato condizioni sperimentali ottimali per ottenere una significativa efficienza di trasfezione, a fronte di una bassa tossicità, nella linea cellulare di leucemia mieloide cronica K562. L'approccio è stato validato tramite lo screening di una collezione di circa 6000 oligonucleotidi siRNA disegnati per silenziare circa 2000 geni i cui prodotti rappresentano putativi bersagli farmacologici. I risultati di questo screening hanno confermato la robustezza delle condizioni sperimentali e hanno permesso di identificare un numero di geni la cui funzione è richiesta per la vitalità o la proliferazione delle K562. Tra questi, è emersa la chinasi ABL, che è un oncogene essenziale in questa linea, insieme ad altri geni coinvolti in processi cellulari fondamentali (per esempio, le chinasi PLK1 e WEE1, alcune subunità del proteasoma, DNA e RNA polimerasi). Tra i geni emersi dallo screening in maniera inattesa, 14 sono stati confermati come nuovi potenziali bersagli molecolari in K562, con un ruolo nel promuovere la vitalità o la proliferazione, oppure nel prevenire il differenziamento terminale. Allo scopo di approfondire lo studio di alcuni di questi geni, è stata implementata una piattaforma di screening fenotipico ad alto contenuto (“high-content screening”) basata sull’analisi di immagine di una variante clonale della linea cellulare K562 che esprime livelli significativi di β-globina, oltre alle globine α e γ normalmente espresse nella linea parentale, che abbiamo nominato “β-K562”. Utilizzando questa linea cellulare, abbiamo sviluppato un saggio multiparametrico che abbina l’analisi del contenuto di DNA e della morfologia nucleare (tramite colorazione con Hoechst 33342) con l’immunofluorescenza della γ-globina (componente dell’emoglobina fetale, HbF) e della β-globina (componente dell’emoglobina adulta, HbA). Questo saggio si è dimostrato sufficientemente robusto e sensibile da permettere l’analisi di variazioni nell’espressione delle globine γ e β in un unico esperimento, ed è stato validato tramite trattamento con noti induttori della γ-globina (idrossiurea, acido butirrico o hemin). L’applicazione di questo saggio alla trasfezione della linea β-K562 con oligonucleotidi siRNA emersi dallo screening ha permesso di identificare diversi geni coinvolti nel differenziamento eritrocitario e nella emoglobinizzazione. Tra di essi, è risultato particolarmente interessante HMOX-2 (Heme oxygenase-2), il cui silenziamento induce un marcato aumento dei livelli di γ-globina. Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che l’inibizione enzimatica di HMOX-2, per mezzo della stagno protoporfirina IX, determina un aumento dei livelli di γ-globina, confermando questo enzima come un potenziale bersaglio molecolare per la riattivazione farmacologica dell’emoglobina fetale.
Author: Marta Durlak
Language: English
Subfield: Hematology
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2345244778