Genomiske ustabilitetsmekanismer : Konstruksjon og undersøkelse av konsekvensene av en mutasjon i PCNA
Year: 2013
Type: dissertation
Abstract: En viktig faktor som kan føre til kreftutvikling er genomisk ustabilitet. Genomisk ustabilitet kan være forårsaket av flere faktorer, blant annet økt forekomst av dobbeltrådbrudd, eller at reparasjonsmekanismer i DNA ikke fungerer optimalt. Kollaps av replikasjonsgafler fører til dobbeltrådbrudd. Dette kan skje både i prokaryote- og eukaryote celler. \nReplisomet til E. coli består blant annet av det sirkulære proteinet β-clamp, som har en svært viktig funksjon under DNA-replikasjonen. β-clamp omgir DNA-tråden og sørger for at DNA-polymerase holder seg festet til DNA-tråden under hele replikasjonen. I Escherichia coli \n(E. coli) er det observert en mutert form av β-clamp som fører til kromosomal fragmentering (ved bruk av puls-felt gelelektroforese), og at noen av replikasjonsgaflene som starter i oriC ikke fullfører (ved måling av markørfrekvens ved hjelp av microarray). Denne muterte formen av β-clamp har en endret aminosyre i posisjon 175. Mutasjonen innebærer at histidin (CAC) har blitt endret til tyrosin (TAC). I eukaryote celler er det tilsvarende proteinet PCNA. Ved å sammenligne de tredimensjonale krystallstrukturene til β-clamp og PCNA, ble det funnet ut at histidin i posisjon 175 i E. coli tilsvarer histidin i posisjon 44 i PCNA. I denne studien var det ønskelig å lage den tilsvarende mutasjonen i PCNA, og undersøke om mutert PCNA ville føre til DNA-skade og cellesyklusproblemer for en human kreftcellelinje.\nSete-dirigert mutagenese ble benyttet for å lage punktmutasjon i humant PCNA. pKL44 (plasmid med gen som koder for mutant-protein) ble transfektert inn i en human kreftcellelinje. Cellene ble analysert for DNA-skade og cellesyklusproblemer ved hjelp av fluorescensmikroskopi og flowcytometri. Høy transfeksjonseffektivitet var gjennomgående i alle forsøkene hvor peGFP-PCNA (villtype) og pKL44 ble transfektert. I cellene som uttrykte eGFP-PCNAH44Y ble det verken observert DNA-skade eller cellesyklusproblemer som var relatert til mutanten. γH2AX-signal (dobbeltrådbrudd) ble under fluorescensmikroskopering detektert i andre celler enn de cellene som uttrykte GFP-PCNA i S-fase. Det vil si at DNA-skaden ikke var i sammenheng med uttrykk av eGFP-PCNAH44Y i S-fasen. DNA-skade ved uttrykk av genet for pKL44 ble sammenlignet med en positiv kontroll av celler som hadde blitt behandlet med CHK1-hemmeren UCN-01. I en stabilt transfektert cellelinje ble det observert lavere uttrykk av eGFP-PCNAH44Y sammenlignet med eGFP-PCNA. I eventuelle videre studier med pKL44, anbefales det at genet som koder for villtype PCNA i cellelinjen gjøres defekt slik at eGFP-PCNAH44Y blir den eneste PCNA til stede i cellene.
Author: Kristine Paulseth Larsen
Language: Norwegian
Topic: DNA Repair Mechanisms
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2397162955