Deciphering the mechanisms underlying the loss of BDNF neuroprotection in an Alzheimer’s disease model
Year: 2016
Type: dissertation
Abstract: O fator neurotrófico derivado do cérebro (Brain-derived neurotrophic factor - BDNF) desempenha importantes funções no sistema nervoso central, nomeadamente diferenciação e sobrevivência neuronais e regulação da transmissão e plasticidade sinápticas. Em algumas doenças neurodegenerativas, como na doença de Alzheimer (Alzheimer’s disease - AD) que se caracteriza por declínio cognitivo e perda de memória, sabe-se que a sinalização mediada pelo BDNF se encontra diminuída. De facto, tanto em doentes como em modelos animais de AD, existem evidências de que os níveis proteicos de BDNF e da isoforma completa do seu recetor, TrkB-FL (full length – FL), se encontram diminuídos. O BDNF tem também a capacidade de se ligar a recetores TrkB truncados (truncated TrkB – TrkB-TC), porém estes recetores são moduladores negativos de TrkB-FL, uma vez que são incapazes de iniciar as vias de sinalização mediadas pelo BDNF. Estudos recentes revelaram que o recetor TrkB-FL é clivado por um grupo de proteases, designadas por calpaínas, resultando na formação de um novo recetor TrkB truncado (TrkB-T’) e de um fragmento intracelular (intracellular domain - ICD) que é translocado para o núcleo. Não se conhecem ainda em profundidade as ações destes novos fragmentos mas sabe-se que a função do BDNF fica severamente comprometida. As calpaínas são proteases dependentes de cálcio, sendo por isso ativadas por um aumento dos níveis intracelulares deste catião. Os recetores N-metil-D-aspartato (NMDARs), importantes mediadores da plasticidade sináptica, são permeáveis a cálcio e podem ser encontrados tanto na região sináptica como na extrassináptica. Enquanto a ativação dos recetores NMDAR sinápticos resulta em alterações que promovem a neuroprotecção, a ativação dos NMDARs extrassinápticos induz, preferencialmente, fenómenos de morte neuronal. Curiosamente, sabe-se que os eNMDARs se encontram sobreactivados em diversas condições patológicas, inclusivamente em modelos de AD, e que podem ter um importante papel na desregulação dos níveis de cálcio intracelular. Assim, o trabalho desenvolvido nesta tese teve como objetivo investigar se a ativação dos eNMDARs contribui para a ativação das calpaínas e consequente clivagem dos recetores TrkB-FL, assim como a perda da sinalização do BDNF. Em primeiro lugar, investigou-se se a prevenção da ativação dos eNMDARs, em neurónios expostos ao péptido β amilóide (amyloid β – Aβ), inibia a clivagem dos recetores TrkB-FL pelas calpaínas. Para testar esta hipótese, culturas primárias de neurónios de rato Sprague-Dawley com 14 dias in vitro (DIV14), foram incubadas durante 24 h com Aβ25-35 (25 μM), o mais pequeno fragmento tóxico do péptido Aβ, e memantina (1 μM), fármaco que bloqueia preferencialmente eNMDARs sobreactivados. Os resultados obtidos indicaram, como esperado, que Aβ25-35 induz um aumento dos níveis dos produtos específicos da clivagem da αII-espectrina mediada pelas calpaínas (specific spectrin breakdown products – SBDP150) sugerindo que existe uma forte ativação destas proteases. Esta alteração traduziu-se na diminuição significativa dos níveis proteicos de TrkB-FL e num aumento nos níveis de TrkB-ICD. Por outro lado, os resultados mostraram, pela primeira vez, que os efeitos de Aβ25-35 são prevenidos pela co-incubação com a memantina: i) a formação de SBDP150 diminuiu, ii) os níveis dos recetores TrkB-FL aumentaram e iii) os níveis de TrkB-ICD diminuíram. Assim, os resultados indicam que a ativação dos eNMDAR parece estar envolvida na ativação das calpaínas e, consequentemente, na clivagem dos recetores TrkB-FL. Uma vez que a formação de novas sinapses são processos que estão na base da formação de memória, pensa-se que as alterações que decorrem no número de espinhas dendríticas num neurónio de um doente de AD tem um papel preponderante nos défices cognitivos que se desenvolvem possivelmente adjacentes à perda neuronal. Sabe-se que o BDNF aumenta o número de espinhas dendríticas, protusões sinápticas através das quais a maioria das sinapses excitatórias ocorre e que correspondem à força de atividade sináptica de um neurónio. Assim, propusemo-nos avaliar, através de imunocitoquímica, se a ativação dos eNMDARs está relacionada com a perda de espinhas dendríticas num neurónio. Os resultados foram obtidos a partir de neurónios provenientes da cultura primária de rato a DIV14. O número de protusões (espinhas dendríticas e filopodia, protusões mais finas) foi quantificado em frações de 10 μm da dentrite-mãe a uma distância de 25 μm do corpo celular do neurónio. Os resultados indicam, como esperado, que Aβ25-35 diminui significativamente o número de protusões e que o BDNF aumenta o número de protusões per se. Na presença de Aβ25-35, os resultados sugerem que o BDNF perde a sua ação no aumento do número de protusões. Essa função é recuperada aquando bloqueio dos eNMDARs com memantina, assim como bloqueio da atividade das calpaínas com MDL28170 (20 μM). Estes resultados propõem que os mecanismos através dos quais Aβ interfere com as espinhas dendríticas envolvem não só a ativação das calpaínas, como visto anteriormente, como também a ativação dos eNMDARs. Por outro lado, foi também nosso propósito avaliar se o bloqueio dos eNMDARs restaurava o efeito do BDNF na potenciação de longa duração (long-term potentiation – LTP) na área CA1 do hipocampo, o mecanismo fisiológico da aprendizagem e memória, cuja magnitude se encontra diminuída na presença de Aβ. Para tal, foram preparadas fatias de hipocampo de rato Wistar com 8-12 semanas de vida e após incubação durante 3h com Aβ25-35 (25 μM) e/ou memantina (1 μM) procedemos ao registo extracelular dos potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (field excitatory postsynaptic potentials – fEPSP) e à indução de LTP na ausência ou presença de BDNF (20 ng/mL). Os dados sugerem, como esperado que, em fatias incubadas exclusivamente com líquido cefalorraquidiano artificial (artificial cerebrospinal fluid - aCSF), o BDNF induz um aumento significativamente da magnitude da LTP e que, na presença de Aβ, o BDNF perde a sua ação na LTP. Curiosamente, os nossos resultados indicam, pela primeira vez, que a co-incubação de memantina e Aβ25–35 restaura a capacidade do BDNF em facilitar a LTP. Estes resultados indicam que a sinalização mediada pelo BDNF na LTP se encontra diminuída na presença de Aβ e que esta diminuição pode ser mediada pela ativação dos eNMDARs. Em conclusão, os resultados sugerem que, na presença de Aβ, a sinalização mediada pelo BDNF se encontra severamente diminuída, afetando as suas ações sinápticas, através de um mecanismo que possivelmente é mediado pela ativação dos eNMDARs. Estas evidências realçam a consequência funcional da clivagem dos recetores TrkB-FL induzida pelo Aβ e propõem a modulação dos eNMDARs de modo a prevenir a desregulação dos níveis intracelulares de cálcio e, consequentemente, a perda dos mecanismos neuroprotetores mediados pelo BDNF.
Author: Sara R. Tanqueiro
Language: English
Subfield: Cellular and Molecular Neuroscience
Field: Neuroscience
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2403521705