Year: 2014
Type: dissertation
Abstract: Piscirickettsia salmonis (P.salmonis) is a small gram-negative intracellular pathogenic bacterium found in farmed and wild salmonid and other marine fish.P. salmonis replicates within membrane-bound cytoplasmic vacuoles in cells of infected fish, leading to a systemic infection, known as salmonid rickettsial septicaemia (SRS), or piscirickettsiosis.Piscirickettsiosis is characterized by necrosis, pale gills, swollen kidney, and enlarged spleen, leading to high rates of mortality in infected fish populations.High rates of mortality due to P. salmonis infections have led to severe economic losses for the salmonid aquaculture industry, causing a loss of at least 100 million US dollars in Chile alone, and even more on a global basis.Due to the effects of piscirickettsiosis on the aquaculture, several studies have been focusing on vaccination and treatment.However, there have been few positive results due to lack of cultivation methods for P. salmonis, only recently it was grown independently of cultured cell lines.In this thesis, improved procedures for growing P. salmonis in the laboratory were established which is a significant leap forward for research on this bacterium.Optimal medium and growth conditions to culture P. salmonis were obtained.Growth rate and CFU/ml could then be measured.When growth measurements were performed, it was discovered that P. salmonis grow better in the dark.Therefore, growth during stress conditions at different alterations in exposure to light was investigated.Several different approaches to make GFP-labeled bacteria were unsuccessful, and it was shown that P. salmonis have naturally occurring plasmids.Antibiotic susceptibility test was performed and P. salmonis strains were found to be sensitive to the majority of antibiotics used in vitro.Electron microscopy studies identified P. salmonis as pleomorphic coccus bacterium of 500-800 nm in size with the secretion of outer membrane vesicles.The outer membrane vesicles were further characterized by both scanning and transmission electron microscopy and the protein content analysis was performed by SDS-PAGE and Western blotting.Additionally, P. salmonis pathogenesis was studied by using the CHSE-214 cell line where the infection rate was approximately 10 % higher in the dark.Additionally, a P. salmonis-zebrafish embryo infection model was established.The bacteria were confirmed to be intracellular by whole-mount immunohistochemistry and by live imaging using transgenic zebrafish lines with fluorescently labeled leukocytes.This thesis lays a solid foundation for further research on P. salmonis and subsequent treatment against piscirickettsiosis.V Sammendrag Piscirickettsia salmonis (P.salmonis) er en liten gram-negativ intracellulær patogen bakterie som har blitt funnet i oppdrett-og frittlevende arter av laksefamilien, men også i andre havfisk.P. salmonis kan formere seg inni cytoplasmiske vakuoler i celler hos infiserte fisk.Dette vil føre til en systemisk sykdom kjent som salmonid rikettsial septikemi (SRS), eller piscirickettsiose.Vanlige symptomer er bleke gjeller, forstørret milt, svulne nyrer og leveren er ofte gjennomsatt av store, lyse, nekrotiske forandringer (lokal vevsdød).Dette kan føre til høy dødelighet i infiserte fiskepopulasjoner.Akvakulturindustrien som driver med oppdrett av laksefisker opplever store økonomiske tap som følge av P. salmonis infeksjon.Chile har et årlig økonomisk tap på minst 100 millioner amerikanske dollar, og dette tallet blir enda større på en global basis.Disse store økonomiske tapene forårsaket av piscirickettsiose i akvakulturen har ført til studier av vaksinering og behandling.Dette har gitt få positive resultater, mest sannsynlig på grunn av manglende kultiverings metoder for P. salmonis.Det ble lenge antatt at P. salmonis kun kunne vokse i fiskecellelinjer, men nylig ble det for første gang påvist at den kan bli kultivert uavhengig av cellelinjer.I denne oppgaven ble det etablert forbedrede prosedyrer for å dyrke P. salmonis på laboratoriet.Dette er et stort framskritt som vil gjøre forskningen på denne bakterien enklere.Det optimale mediet og forholdene for dyrkning ble funnet, og vekst og CFU/ml ble målt.Under vekst-målingene ble det observert at P. salmonis vokste bedre i mørket enn i lyset.Derfor ble bakterien utsatt for stress i tillegg til lys og mørke forhold.Det ble testet flere metoder for å lage GFP-merkede P. salmonis mutanter, uten noe suksess.I denne oppgaven ble det også vist at P. salmonis har naturlige plasmider.I tillegg ble antibiotika sensitivitet testet som viste at bakteriene var veldig følsomme for ulike typer antibiotika in vitro.Elektron mikroskop ble videre brukt for å identifisere størrelsen og formen på bakteriene som viste at de var runde med en størrelse på 500-800 nm.Ved å bruke skanning og transmisjon elektronmikroskop ble det observert at P. salmonis sekrerer yttermembranvesikler. Protein innholdet i disse vesiklene ble videre analysert ved SDS-PAGE og Western blotting.P. salmonis patogenese ble også studert ved å benytte CHSE-214 cellelinjen der infeksjonen viste seg å være 10 % høyere i mørke, og en P. salmonis-sebrafisk embryo infeksjonsmodellen ble etablert.Bakterien ble bekreftet å være intracellulær med en immunhistokjemisk metode og ved å bruke transgene sebrafisklinjer med fluoriserende leukocytter.Resultatene i denne oppgaven gir et godt fundament for forskning på P. salmonis og for videre studier nødvendig for å finne en effektiv behandling imot piscirickettsiose. VI Table of contentsAcknowledgements…………………………………………………………………………...
Author: Eva Berger
Language: English
Subfield: Immunology
Field: Immunology and Microbiology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
Funder: Universitetet i Oslo
OpenAlex ID: W2473829649