Genomweite Annotation von Translationsinitiationsstellen in der humanen Monozyten-Zelllinie THP-1
Year: 2013
Type: dissertation
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurde die erste genomweite Annotation von Translationsinitiationsstellen (TISs) in einer humanen Zelllinie durchgeführt. Insgesamt wurden 7251 TISs in 5062 Transkripten, welche die definierten Analysekriterien erfüllten, detektiert. Die Identifizierung von TISs basierte bis vor einiger Zeit hauptsächlich auf bioinformatischen Analysen, wobei alternative non-AUG Startstellen nicht erfasst wurden. Zahlreiche Studien dokumentieren, dass die Translation nicht nur an der kanonischen CDS sondern auch an alternativen AUG und non-AUG Startcodonen in der 5´-UTR der Transkripte initiiert. Diese upstream lokalisierten Translationsinitiationsstellen repräsentieren Upstream-open-Reading-Frames (uORFs) und CDS überlappende uORFs (ovuORFs), die entscheidende regulatorische Funktionen für die Genexpression haben können, sowie N-terminale Proteinextensionen, welche für die subzelluläre Proteinsortierung maßgeblich sein können. Infolge einer funktionellen Klassifizierung der 7251 vorhergesagten TISs wurden 2305 kanonische Starts, 2994 neue uORFs, 1406 neue ovuORFs und 546 neue N-terminale Proteinextensionen dokumentiert. Als Voraussetzung für eine erfolgreiche Durchführung musste zunächst das Ribosomen-Profiling etabliert werden, das auf der Sequenzierung von durch Ribosomen geschützten ca. 30 nt langen mRNA-Fragmenten basiert. Die akkurate Identifizierung der Startstellen erfolgte anschließend durch die Behandlung der Zellen mit Puromycin und Cycloheximid, wodurch die Ribosomen an den TISs der Transkripte angereichert wurden. Mit Hilfe eines künstlichen neuronalen Netzes, das mit ribosomalen Footprints an zuvor annotierten AUG Startstellen trainiert wurde, wurden die TISs daraufhin systematisch annotiert. Um die Qualität der Methode und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse dieser Arbeit zu validieren, wurden die hier bestimmten TISs mit zuvor in der Literatur beschriebenen alternativen non-AUG Startstellen und uORFs verglichen. Letztendlich wurde die Konservierung der Translationsinitiationscodonen (TICs) analysiert. Sowohl AUG- als auch non-AUG-Startcodonen sind zwischen Primaten und zwischen Menschen und Nagetieren stark konserviert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit verdeutlicht, wie unerwartet oft die Translation an alternativen TISs initiiert und wie komplex und relevant demzufolge die translationale Regulation für die Genexpression ist.
Author: Claudia Fritsch
Language: German
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2537315921