Alternative splicing and SR proteins in ABA-mediated stress responses
Year: 2016
Type: dissertation
Abstract: Condições ambientais de stress, tais como a seca, a elevada salinidade e temperaturas extremas, constituem as causas mais comuns de perda de produtividade agrícola a nível mundial. Estes tipos de stress resultam em stress osmótico, sendo caracterizados pela redução da água disponível que a planta consegue utilizar. Não possuindo capacidade de locomoção, as plantas desenvolveram estratégias adaptativas únicas, quer a nível de desenvolvimento quer a nível fisiológico, que lhes permitem fazer face a um ambiente em constante mudança. As hormonas vegetais têm um papel crucial nesta resposta, atuando não só como reguladores do crescimento e desenvolvimento vegetal, mas também como mediadores da resposta ao stress. Dentro das diferentes fitohormonas, destaca-se o ácido abscísico (ABA). Em resposta ao stress osmótico é promovida na planta a síntese desta hormona, que será responsável pela ativação/repressão de diversas cascatas de sinalização, regulando numa última fase alterações na expressão génica de modo a tolerar ou combater o stress. Esta hormona é igualmente responsável pela regulação da maturação e do estado de dormência das sementes, atuando posteriormente no desenvolvimento do embrião e na sua germinação. Em condições de stress, o ABA reprime a germinação e, em estados mais tardios do desenvolvimento, é responsável pelo controlo da abertura estomática, prevenindo perdas excessivas de água por transpiração. O estudo das vias de sinalização dependentes desta hormona tem-se intensificado nos últimos anos, existindo cada vez mais evidências que apontam para uma ligação entre as respostas ao stress dependentes do ABA e o processamento do mARN através do mecanismo de splicing. A maioria dos genes dos organismos eucariotas contém regiões codificantes, denominadas exões, interrompidas por regiões não-codificantes, os intrões. O processo pelo qual os intrões são removidos do mARN precursor (pré-mARN) e os exões ligados entre si denomina-se splicing. Múltiplas formas de mARN maduro podem ser obtidas a partir de um único pré-mARN através de um mecanismo conhecido por splicing alternativo. Este processo permite a produção de mais do que uma proteína a partir de um único gene, contribuindo assim decisivamente para a criação de diversidade transcritómica e proteómica. Por outro lado, este mecanismo proporciona uma forma rápida e versátil de regular a expressão génica, o que pode desempenhar um papel importante nos processos de adaptação das plantas. Nos últimos anos, o número de exemplos de splicing alternativo descrito em plantas tem aumentado exponencialmente, havendo evidências crescentes de que este mecanismo de regulação pós-transcricional desempenha um papel fundamental na resposta das plantas ao stress ambiental. As proteínas SR, ricas em serina e arginina, constituem uma família altamente conservada de fatores de splicing, presentes tanto em metazoários como em plantas. Caracterizam-se estruturalmente por possuírem um ou dois domínios de reconhecimento do ARN (RRM) e um domínio rico em dipéptidos de serina e arginina (RS), responsável por interações proteína-proteína. Em comparação com os animais, as plantas possuem um maior número de proteínas SR, em parte devido a duplicação génica intercromossómica. Não se sabe ainda se os genes parálogos resultantes destas duplicações possuem funções redundantes ou se são capazes de desempenhar papéis diferentes, tendo sido apenas demonstrado que alguns destes pares de parálogos possuem perfis de expressão diferentes durante o desenvolvimento vegetal. No genoma de Arabidopsis thaliana existem vinte genes codificando proteínas SR ou semelhantes, seis dos quais possuem um gene parálogo. As proteínas SR são essenciais na regulação tanto do splicing constitutivo como no splicing alternativo, desempenhando um papel-chave nas etapas iniciais de montagem do spliceossoma, influenciando a escolha dos sítios de splicing em função da sua concentração e do seu nível de fosforilação. Os genes que codificam estas proteínas são eles próprios alvos de splicing alternativo, tornando possível aumentar em seis vezes a complexidade do seu transcritoma. Todavia, em Arabidopsis thaliana, a maioria destas variantes de splicing contém codões de terminação prematuros, codificando proteínas incapazes de realizar a sua função e que constituem alvos para degradação celular. Existem poucos estudos disponíveis visando a caracterização de proteínas SR em plantas. No entanto, dados recentes apontam para estas proteínas como principais coordenadoras na resposta ao stress, tendo como alvo a via de sinalização do ABA. Um exemplo é o caso da proteína SCL30a, pertencente à subfamília SCL de proteínas SR de Arabidopsis thaliana. O laboratório de Biologia Molecular de Plantas, onde o trabalho desta tese foi desenvolvido, descobriu recentemente que um mutante para o gene SCL30a de Arabidopsis apresenta hipersensibilidade a condições de stress osmótico durante a germinação da semente, e que esta resposta é dependente da hormona ABA. Por outro lado, o mesmo laboratório reportou que o tratamento com ABA exógeno e/ou a alteração dos níveis de expressão de componentes essenciais à síntese ou sinalização desta hormona alteram significativamente a expressão de oito genes codificando proteínas SR em Arabidopsis. O presente trabalho foi iniciado com o objetivo de compreender o papel biológico do splicing alternativo no crescimento e desenvolvimento das plantas, utilizando Arabidopsis thaliana como organismo modelo. Neste estudo, através da utilização de genética reversa e análises de localização subcelular, investigámos as funções in vivo de duas proteínas SR de Arabidopsis: a SR34, pertencente à subfamília SR, e a SCL33, um parálogo da SCL30a, ambas pertencentes à subfamília SCL. Os níveis de expressão destas dois genes SR, SR34 e SCL33, são regulados pelo ABA e, no presente trabalho, fornecem-se evidências de que de facto estes dois fatores de splicing desempenham um papel nas respostas ao stress mediadas por esta fitohormona. Este estudo teve início com a caracterização funcional do gene SR34, que se descobriu gerar pelo menos três variantes de splicing alternativo. Um mutante com níveis de expressão deste gene fortemente reduzidos mostrou ser hipersensível durante a germinação da semente em condições de stress cuja resposta é mediada pela hormona ABA. Este resultado preliminar sugere que o factor de splicing SR34 constitui um regulador negativo da resposta ao stress durante a germinação. Adicionalmente, por análise da localização subcelular das três isoformas de splicing da SR34, concluímos que o splicing alternativo deste gene não influencia a localização subcelular da proteína que codifica. Quando expressas de forma transiente em N. benthamiana, todas as isoformas de splicing apresentaram uma estrita localização nuclear, substanciando o papel desta proteína no processo de splicing. Surpreendentemente, quando expressas de forma constitutiva em Arabidopsis thaliana, a sua localização não se limitou apenas ao núcleo celular, tendo sido observadas igualmente no citoplasma das células, sugerindo um papel mais generalizado para estas proteínas. Por outro lado, este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente o gene SCL33 e compreender uma possível interação genética com o seu parálogo SCL30a. Por análise de um conjunto de mutantes onde a expressão destes genes se encontra afetada, demonstrámos que por si só o gene SCL33 não parece estar envolvido na resposta a condições de stress durante a germinação da semente ou durante o desenvolvimento vegetal precoce. No entanto, a utilização de um duplo mutante para estes genes permitiu verificar que, na ausência de ambos, o fenótipo descrito para o mutante do gene SCL30a é resgatado, sugerindo que as proteínas SCL30a e SCL33 atuam de forma antagónica na mesma via de sinalização de resposta a stress mediada pela hormona ABA. Tanto para os genes SCL33 e SCl30a, como para o SR34, observou-se uma expressão generalizada dos seus transcritos em diferentes órgãos e ao longo do desenvolvimento vegetal. Estes resultados poderão assim sugerir um papel para estas proteínas para além da fase precoce do desenvolvimento. No entanto, ainda que globalmente expressos, este estudo demonstra que mutantes para estas proteínas não apresentam defeitos, comparativamente ao controlo, na regulação da abertura estomática. Em suma, o trabalho aqui apresentado fornece uma importante contribuição para a elucidação do papel das proteínas SR, e consequentemente da relevância biológica do splicing alternativo, na resposta das plantas ao stress, durante a germinação da semente. Adicionalmente, aqui reportamos uma expressão generalizada para estas proteínas SR, sugerindo que estes fatores de splicing poderão regular variados processos celulares ao longo dos diferentes estágios de desenvolvimento vegetal, não estando a sua função limitada ao processo de germinação da semente ou a condições de stress.
Author: Filipa L. Lopes
Language: English
Subfield: Plant Science
Domain: Life Sciences
SDG: Zero hunger
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2542485045