The Generation of Astrocytes from Stem Cells and their Potency to Regain Stem Cell Potential
Year: 2016
Type: dissertation
Abstract: Astrocytes are the most abundant cell type in the central nervous system, and they fulfill diverse vital roles under physiological as well as pathophysiological conditions.Recognition of new functions, such as the stem cell potential of astrocytes, or their ability to actively regulate neurotransmission, raised renewed interest for these cells in both basic and pharmacological research.Primary monolayer cultures have become the dominating model system to study astrocyte functions in vitro.These cultures are often heterogeneous, resulting in contradictory studies, e.g., in inflammation, or the misinterpretation of data obtained on 'mature' astrocytes, e.g., in transcriptomic profiling.An alternative approach is the generation of astrocytes from stem cells.We developed here a protocol for the generation of pure populations of mature, non-dividing astrocytes.These 'murine astrocytes generated from embryonic stem cells' (mAGES) express markers specific for mature astrocytes, and perform astrocytic functions, such as the response to inflammatory cytokines, or the (metabolic) support of neurons.The absence of immature cells allowed a direct comparison of mAGES with the neural stem cells (NSC) from which they arise.It is known that astrocytes and NSC share several phenotypic and functional features, but a direct comparison proved difficult due the heterogeneity of primary cultures and the lack of markers, which clearly discriminate astrocytes from NSC. Transcriptome data of pure cultures of mAGES and NSC were used to re-evaluate known cell type-specific markers, and to identify new ones.Furthermore, studies on the metabolic profiles of these cells not only confirmed their close relationship, but also revealed clear differences regarding the glutamate/glutamine metabolism as well as citrate release.In the second part of this study, the properties of mAGES (homogeneity, maturity) were used to study the de-differentiation of astrocytes to neural stem cells.This new research field emerged from the finding that neural stem cells of the adult brain are astrocytic cells, and that reactive astrocytes in pathological environments regain stem cells features.For studies on de-differentiation, homogeneous populations of mature astrocytes are desirable to investigate responsible signaling mechanisms and pathways.We demonstrated here that the addition of a single growth factor under strictly controlled conditions was sufficient to de-differentiate mAGES to neural stem-like cells (NSC2).The mAGES re-entered the cell cycle, when exposed to FGF2, and gave rise to cells expressing the neural vi stem cell marker nestin, while the astrocytic glial fibrillary acidic protein (GFAP) was downregulated.NSC2 were multipotent neural stem cells, which further differentiated into both astrocytes and neurons, and they resembled normal neural stem cells with regard to their phenotype and functions.Downstream of FGF2, the phosphorylation of ERK has been shown to be the main pathway responsible for the cell cycle re-entry of mAGES.Under pathophysiological conditions, i.e., the exposure of mAGES to inflammatory cytokines, the de-differentiation to NSC2 was disturbed.IFNγ was shown to inhibit the cell cycle re-entry of mAGES by a phosphorylation of STAT1.Ruxolitinib, an inhibitor of the JAK/STAT pathway, was sufficient to recover the de-differentiation of mAGES, even in the presence of IFNγ and other cytokines.These findings may explain, why the dedifferentiation is a rare event in pathology models, as the positive stimuli (FGF2) is, under such situation, always coupled with inhibitory, inflammatory events.Thus, mature astrocytes have been shown to de-differentiate into neurogenic neural stem cells, and inducing or inhibiting signals could be identified and characterized in this system.viiZUSAMMENFASSUNG Astrozyten sind die am zahlreichsten vertretenen Zelltypen im zentralen Nervensystem.Sie erfüllen eine Vielzahl an unterschiedlichen Funktionen sowohl im gesunden, als auch im erkrankten Nervensystem.Die Entdeckung neuer Funktionen, beispielsweise dem Potential dieser Zellen Stammzellen zu generieren oder ihrer aktiven Beteiligung an der Reizweiterleitung in Nervenzellen, hat erneutes Interesse an der Erforschung dieser Zellen geweckt.Um die Funktionen von Astrozyten in vitro zu erforschen, werden hauptsächlich primäre Monolayerkulturen verwendet.Diese Kulturen enthalten allerdings häufig unterschiedliche Zelltypen, was zu widersprüchlichen Ergebnissen, wie beispielsweise in der Entzündungsforschung, oder einer Fehlinterpretation von Daten, wie zum Beispiel in Microarray-Studien, geführt hat.Ein alternativer Ansatz ist die Generierung von Astrozyten aus Stammzellen.Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Reinkulturen bestehend aus reifen, sich nicht mehr teilenden Astrozyten.Diese ‚Maus-Astrozyten, generiert von embryonalen Stammzellen' (mAGES), zeigen Expressionsmuster sowie Funktionen, die typischerweise in reifen Astrozyten vorkommen, wie zum Beispiel Entzündungsreaktionen oder die (metabolische) Unterstützung von Nervenzellen.Da die Kulturen keine unreifen Vorläuferzellen enthalten, ist ein direkter Vergleich zwischen den reifen Astrozyten und den neuralen Stammzellen (NSC), aus denen sie differenziert werden, möglich.Beide Zelltypen ähneln einander in vielerlei Hinsicht.Ein direkter Vergleich war bisher allerdings schwierig, da Primärkulturen meist beide Zelltypen enthalten und nur wenige Merkmale bekannt sind, die eine eindeutige Unterscheidung beider Zelltypen erlauben.Eine Analyse des Transkriptoms dieser Reinkulturen von mAGES und NSC ermöglichte eine Neubewertung bisher bekannter zelltypspezifischer Marker sowie die Identifizierung neuer Merkmale zur besseren Unterscheidung.Darüber hinaus haben metabolische Untersuchungen nicht nur die nahe Verwandtschaft zwischen Astrozyten und NSC belegt, sondern auch klare Unterschiede, bezogen auf den Glutamat/Glutamine-Stoffwechsel sowie die Freisetzung von Citrat, aufgezeigt.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden mAGES, aufgrund ihrer Homogenität und Ähnlichkeit mit reifen Astrozyten, dazu verwendet, die De-Differenzierung von Astrozyten hin zu neuralen Stammzellen zu erforschen.Dieses recht junge viii Forschungsfeld beruht auf den Entdeckungen, dass neurale Stammzellen im Erwachsenen-Gehirn astrozytäre Merkmale aufweisen, und dass reife Astrozyten unter bestimmten pathologischen Veränderungen Stammzellmerkmale wiedererlangen.Studien zur De-Differenzierung erfordern homogene Kulturen von reifen Astrozyten, ohne eine Verunreinigung mit unreifen Zellen, um Mechanismen und Signalwege der Zellumwandlung zu erforschen.Es wurde gezeigt, dass die Zugabe eines einzelnen Wachstumsfaktors unter streng kontrollierten Bedingungen ausreicht, um mAGES zu neuralen Stammzellen (NSC2) zu de-differenzieren.Reife mAGES reaktivieren ihren Zellzyklus und teilen sich wieder, sobald sie mit FGF2 stimuliert werden.Sie exprimieren verstärkt den neuralen Stammzellmarker Nestin, während das astrozytäre ‚glial fibrillary acidic protein' (GFAP) herunterreguliert wird.NSC2 sind multipotente Stammzellen, welche sowohl zu Astrozyten als auch zu Nervenzellen differenzieren können.Außerdem gleichen sie neuralen Stammzellen in Bezug auf ihren Phänotyp und ihre Funktionen.Die Phosphorylierung von ERK, ausgelöst durch die Stimulation mit FGF2, ist hauptverantwortlich für das Wiederanschalten des Zellzyklus in mAGES.Unter pathologischen Bedingungen, in diesem Fall der Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen, war die Umwandlung von mAGES zu neuralen Stammzellen gestört.IFNγ verhinderte das Wiederanschalten des Zellzyklus durch eine Phosphorylierung von STAT1.Die Zugabe von Ruxolitinib, einem Inhibitor des JAK/STAT-Signalweges, war wiederum ausreichend, um die Umwandlung von mAGES, selbst in Gegenwart von IFNγ und anderen Zytokinen, zu ermöglichen.Diese Ergebnisse könnten erklären, warum eine De-Differenzierung in Krankheitsmodellen nur selten vorkommt, da der positive Stimulus (FGF2) immer in Verbindung mit hemmenden, entzündlichen Faktoren auftritt.Insgesamt wurde jedoch gezeigt, dass reife Astrozyten direkt in neurogene neurale Stammzellen umgewandelt werden können, und dass diese Umwandlung sowohl positiv, als auch negativ beeinflusst werden kann.Dadurch können künftig Mechanismen identifiziert und erforscht werden, welche eine De-Differenzierung von Astrozyten fördern oder hemmen.
Source: KOPS (University of Konstanz)
Author: Susanne Kleiderman
Language: English
Subfield: Developmental Neuroscience
Field: Neuroscience
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2552361231