A Chloroplastidial Atypical Aspartic Protease from Arabidopsis thaliana:Optimization of Heterologous Expression, Purification and Biochemical Characterization
Year: 2013
Type: dissertation
Abstract: As proteases aspárticas estão amplamente distribuídas por todos os reinos biológicos. O reino das plantas apresenta um número mais elevado de proteases aspárticas do que os restantes reinos biológicos, o que sugere que estas possam ter um papel importante nos seus processos biológicos. As proteases aspárticas atípicas de plantas possuem características únicas. Apresentam uma organização muito diferente da sua estrutura primária (não possuem o domínio PSI), possuem um elevado conteúdo em cisteínas e uma sequência de aminoácidos única à volta da primeira tríade catalítica (hidrofóbico-hidrofóbico-DTG-serina-acídico). Estas proteases têm localizações celulares pouco usuais e vários autores afirmam que estas enzimas possuem uma função especializada, estando envolvidas em processos altamente regulados. A NP_181826 (At2g42980) é uma protease aspártica atípica cloroplastidial de Arabidopsis thaliana. Esta protease possui um domínio de ligação a DNA, o que sugere que o DNA poderá ter um efeito de regulação da actividade da protease. Esta protease também apresenta uma presequência bipartida. Este tipo de presequência só foi descrito em organismos que sofreram um processo de endossimbiose duplo, sendo que nunca foi encontrada em plantas superiores como a Arabidopsis thaliana. As suas características únicas e o facto de se encontrar no cloroplasto sugerem que esta protease aspártica possa ter um papel extremamente importante neste organelo. O objectivo deste trabalho consistiu em estabelecer e optimizar protocolos de expressão e purificação para a produção da NP_181826, usando E.coli como sistema heterólogo de expressão. Neste estudo, uma putativa forma madura da NP_181826 (35toDTG) foi clonada e expressa neste sistema. Várias estratégias foram utilizadas para optimizar a sua expressão e purificação. Quando expressa na forma solúvel, a forma recombinante 35toDTG apresentou tendência para ser co-purificada com outras proteínas e a quantidade de proteína obtida foi muito baixa. A expressão na forma de corpos de inclusão seguida de um processo de refolding por diálise resultou na melhor estratégia para obter quantidades elevadas de proteína purificada. A proteína recombinante 35toDTG apresentou actividade proteolítica contra o substrato típico das protease aspárticas, com um pH óptimo a 3.5. Esta protease aparenta ter uma especificidade muito restrita, sendo capaz de cortar a cadeia β oxidada da insulina em apenas um local. A sua completa inibição na presença de Pepstatina A e a perda total de actividade do seu mutante do local activo colocam esta protease na família A1 das proteases aspárticas. A inibição com DTT e GSH, não havendo qualquer inibição com GSSG, e o efeito de activação por parte do NADH e ADT levam a concluir que o ambiente redox e a presença de nucleótidos podem influenciar directamente a estabilidade e/ou actividade catalítica desta protease aspártica atípica. Os resultados experimentais sugerem que a NP_181826 poderá ter uma função altamente específica no cloroplasto da Arabidopsis e que o ambiente redox do cloroplasto poderá influenciar directamente a sua actividade proteolítica.
Author: Daniela Dias‐Pedroso
Language: English
Subfield: Cancer Research
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2607301277