Year: 2008
Type: dissertation
Abstract: As mitocôndrias são organelos dinâmicos que geram ATP por fosforilação oxidativa. Este processo depende da existência de um gradiente electroquímico ao longo da membrana mitocondrial interna, gerado pelo bom funcionamento da cadeia respiratória mitocondrial, e cujos complexos proteicos são codificados por dois genomas: o genoma nuclear e o genoma mitocondrial. Os espermatozóides humanos contêm um número variável de mitocôndrias na peça intermédia, que são responsáveis pelo fornecimento de energia para as mais diversas funções celulares, incluindo a mobilidade dos gâmetas masculinos. Com o objectivo de clarificar o papel da mitocôndria e do seu genoma (ADNmt) no funcionamento dos espermatozóides e na (in)fertilidade masculina, procedeu-se à análise de uma série de aspectos celulares e moleculares relacionados com a mitocôndria. Para isso, usaram-se amostras de esperma de qualidade distinta, fornecidas por pacientes que recorreram a um laboratório de reprodução assistida. Mostrou-se, através da técnica de PCR em tempo real, que os espermatozóides humanos possuem um número variável de moléculas de ADNmt, e que o conteúdo em ADNmt é baixo, quando comparado com células somáticas. Além disso, este conteúdo parece ser inversamente proporcional à qualidade espermática. Numa tentativa de entender a razão pela qual amostras de diferente qualidade apresentam conteúdos dissimilares de ADNmt, procedeu-se ao estudo de duas proteínas relacionadas com a sua manutenção: a ADN polimerase gama (POLG, a única ADN polimerase existente na mitocôndria) e o factor de transcrição mitocondrial A (TFAM; que está envolvido nos processos de transcrição e replicação do ADNmt). Antes de mais, usando as técnicas de imunocitoquímica e “western-blotting”, mostrou-se que espermatozóides humanos expressam estas duas proteínas na peça intermédia. Para além disso, a expressão destes dois factores parece estar correlacionada com os principais parâmetros de avaliação da qualidade seminal (concentração, mobilidade e morfologia dos espermatozóides). Resultados semelhantes foram obtidos para a expressão de duas proteínas da cadeia respiratória: subunidades I e VIc da citocromo c oxidase (COXI e COXVIc, respectivamente). Paradoxalmente, a presença de POLG parece predizer, de forma inversa, o conteúdo em ADNmt. Este factor poderá, então, ter um papel na regulação do número de cópias de ADNmt em espermatozóides, embora os mecanismos desta possível regulação não tenham sido determinados. A relevância da POLG na função espermática foi também estudada a nível genético, tendo este estudo incidido particularmente numa região do gene que contém repetições de nucleótidos CAG de tamanho variável. Para isso, usaram-se as técnicas de PCR de fluorescência e sequenciação de ADN. Os resultados mostraram que, embora as amostras de pior qualidade apresentem uma maior incidência de heterozigotia, este polimorfismo não parece afectar os principais parâmetros seminíferos, nem o conteúdo em ADNmt, ou a expressão de POLG. Assim, e apesar do significado biológico destes variantes genéticos não ter sido clarificado, a sua análise não parece ter relevância clínica. Por outro lado, a análise de subpopulações de espermatozóides com capacidade de movimentação distinta (isoladas usando o método clássico de “swim-up”) confirmou a correlação entre a expressão das proteínas POLG e COXI e a mobilidade espermática. Além disso, o estudo de fracções de espermatozóides com diferente potencial de membrana mitocondrial (usando a sonda “MitoTracker Green” e um aparelho de “sorting” celular) sugeriu que a expressão destas proteínas contribui para a manutenção da função mitocondrial. A capacidade da sonda “MitoTracker Green” (bem como das sondas “MitoTracker Red” e “JC-1”) monitorizar o potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides foi determinada usando microscopia de fluorescência, através da incubação de espermatozóides com disruptores do potencial, tanto antes como após a incubação com as sondas. Qualquer xiii uma das três sondas parece monitorizar o potencial de membrana de espermatozóides no momento da incubação. No entanto, nenhuma delas é suficientemente dinâmica para revelar alterações no potencial que ocorram após a incubação dos espermatozóides com as sondas. Por último, procedeu-se a um estudo preliminar usando diferentes marcadores celulares, com o intuito de determinar o possível valor clínico da análise dos seguintes parâmetros funcionais: potencial de membrana mitocondrial, integridade membranar, estado do acrossoma e estado da cromatina. Neste estudo foram usadas, não apenas amostras de pacientes que recorreram a um laboratório de reprodução assistida, mas também amostras de dadores saudáveis. Os resultados sugerem que todos os parâmetros avaliados são significantes, em especial a análise do potencial de membrana mitocondrial e da integridade membranar.
Author: Maria Alexandra Barreto Amaral
Language: English
Subfield: Reproductive Medicine
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
Award: G4508731996
OpenAlex ID: W2612060143