Year: 2005
Type: dissertation
Abstract: In der vorliegenden Doktorarbeit konnte die Produktion von zwei komplexen humanen Proteinen, dem therapeutisch relevanten anti-HIV IgG1/kappa Volllängenantikörper: (BY-2)2F5, und einer löslichen Form des hochaffinen Rezeptors für humanes IgG: Fc-gamma-RI (CD64), erfolgreich für die heterologe Expression in Pflanzen, Bakterien und Säugerzellen etabliert und optimiert werden. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Protokolls für die Expression und Aufreinigung des anti-HIV Antikörpers 2F5 in Pflanzensuspensionskulturen (BY-2). Aus 340g BY-2 Pellet konnte 1mg/L reiner und intakter Antikörper aufgereinigt werden. Im ELISA, EMSA und SPR zeigte diese Präparation vergleichbare Antigenbindungskapazitäten wie der in CHO-Zellen produzierte Kontrollantikörper. Ein negativer Einfluss der pflanzlichen Glykosylierung konnte in Neutralisationsversuchen in Wien ausgeschlossen werden. Fermentationsexperimente konnten zeigen, dass BY-2 Zellen ohne Einschränkung bis in den 100-L Maßstab wachsen, allerdings müssen die Bedingungen für eine stabile Antikörperproduktion und -aufreinigung intensiver untersucht werden. Für eine GMP-Implementierung und eine Expression im Großmaßstab unter definierten Bedingungen müssen zuerst geeignete Protokolle und Abläufe etabliert werden. Basierend auf den Erfahrungen einer 100-L Aufreinigung, konnten Vorschläge für geeignete Geräte gemacht werden, um 100-L BY-2 Kultur in ungefähr 2 Tagen unter GMP-Bedingungen aufzureinigen. Das zweite Ziel dieser Arbeit bestand in der Expression von löslichem Fc-gamma-RI in einem geeigneten Expressionssystem. Dafür wurde die extrazelluläre Domäne von Fc-gamma-RI generiert und in verschiedene Vektoren für die Expression in E.coli, Säuger- und Pflanzenzellen kloniert. Diese drei Systeme wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, funktionales CD64 zu produzieren. Mit 1 mg/l konnten die höchsten Expressionraten in dem Säugerzellsystem erreicht werden. Die entsprechenden Expressions- und Aufreinigungsprotokolle wurden optimiert und sowohl die Reinheit als auch die Integrität des rekombinanten löslichen CD64 (rsCD64) konnte bestätigt werden. Die Funktionalität wurde über die Bindung von humanem IgG in ELISA und SPR Untersuchungen verifiziert. Abschließend konnte man sagen, dass die Funktionalität des rsCD64 vergleichbar war mit der des originalen, membrangebundenen Rezeptors. Funktionelles und lösliches Protein ist eine der Voraussetzungen für eine intensive Charakterisierung von Fc-gamma-RI. Dies wird zu einem besseren Verständnis der Funktion von Fc-gamma-RI führen und die Entwicklung spezifischer Fc-gamma-RI getargeter Therapeutika fördern.
Source: RWTH Publications (RWTH Aachen)
Authors: Antje Pätz, Rainer Fischer
Language: English
Subfield: Biotechnology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2617551050