Localization of secretases involved in the processing of β- Amyloid precursor protein related to alzheimer’s disease
Year: 2013
Type: dissertation
Abstract: As fases iniciais da doença de Alzheimer são caracterizadas por alterações na eficiência sináptica, que se pensa serem causadas por oligómeros solúveis dos peptídeos β-amilóide (Aβ). Estes peptídeos são formados a partir da clivagem proteolítica da proteína precursora β-amilóide (APP), através da ação de secretases (α- e β-). Apesar de se saber que a formação de Aβ a nível sináptico é provavelmente crucial para o dano inicialmente verificado na doença de Alzheimer, a distribuição da APP e das secretases (α- β- e γ-) envolvidas no seu processamento proteolítico, em diferentes terminais nervosos, permanece desconhecida. Não se sabe ainda por que razão apenas alguns tipos específicos de sinapses sofrem degeneração nas fases iniciais da doença. É ainda mais surpreendente o facto de não ser conhecida a distribuição a nível sináptico e subsináptico da APP e das secretases, em diferentes tipos de terminais nervosos, em diversas regiões cerebrais, bem como o facto de se desconhecer se esta distribuição sofre alterações em modelos animais da patologia de Alzheimer. Os principais objetivos deste trabalho eram: i) investigar a distribuição sináptica e sub-sináptica (zonas pré-, pós- e extra-sinápticas) da APP e das secretases (α- β- e γ-), com particular foco no hipocampo, ii) definir a presença de APP e das secretases, bem como a sua co-localização em diferentes tipos de terminais nervosos, principalmente glutamatérgicos e GABAérgicos e iii) investigar se a idade e condições de doença de Alzheimer afectam a distribuição da APP e das secretases em terminais nervosos. A distribuição sináptica e a densidade da APP, da BACE1 (β-secretase), da ADAM-10 (α- secretase) e da presenilina -1 (PS1, um componente da γ-secretase) foram avaliadas por Western blot e imunocitoquímica, em preparações sinápticas de hipocampo (sinaptossomas e terminais nervosos purificados), que foram obtidas a partir de murganhos machos adultos C57/Bl6, com 2-3 meses de idade, a partir de murganhos do mesmo tipo, com 9 meses de idade, e também a partir de murganhos triplos transgénicos modelos da doença de Alzheimer. Recorrendo a um protocolo de fracionamento sináptico, que permite a separação das fracções pré-, pós- e extrasinápticas, avaliámos ainda a distribuição sub-sináptica relativa da APP e das secretases. Além disso, fizemos também um estudo preliminar para determinar os níveis de APP em amostras de cérebro humano de indivíduos com diferentes idades. No hipocampo de murganhos jovens adultos (2-3 meses), através da comparação das imunoreactividades da APP e das secretases em sinaptossomas (terminais nervosos) e membranas totais, verificámos que a APP, a α- e a β-secretases se encontram presentes em terminais nervosos, apesar de não estarem enriquecidas nos sinaptossomas. Também observámos que a APP está localizada preferencialmente a nível pré-sináptico, a α- secretase (ADAM10) se encontra distribuída pré- e extra-sinapticamente, ao passo que a β-secretase (BACE1) se encontra principalmente na fração extra-sináptica. Através de análise imunocitoquímica, em terminais pré-sinápticos do hipocampo, purificados e plaqueados, verificamos que a APP é mais abundante do que as secretases (ADAM10, BACE1 e presenilina1, PS1), que a APP e a BACE1 estão parcialmente co-localizadas em cerca de 40% e ainda que esta secretase se encontra mais presente nos terminais glutamatérgicos do que nos GABAérgicos. Inesperadamente, não observamos diferenças significativas na densidade da APP e das α- e β-secretases, nos sinaptossomas de hipocampo de murganhos adultos (9 meses de idade), em comparação com murganhos jovens adultos (2-3 meses de idade). Por outro lado, em amostras de cérebro humano verificámos uma clara diminuição da densidade da APP com o aumento da idade (resultados preliminares). Em murganhos triplos transgénicos modelos da doença Alzheimer, observámos uma clara diminuição da imunoreactividade da ADAM10, bem como um aumento da PS1, por análise de imunocitoquímica. Os resultados apresentados neste estudo representam a primeira análise comparativa das distribuições sináptica e sub-sináptica da APP e das secretases, em regiões corticais (principalmente do hipocampo) do cérebro de murganhos, bem como da avaliação da abundância relativa da APP e das secretases e da sua co-localização, em diferentes terminais nervosos de hipocampo. Foi também avaliada a existência de alterações relacionadas com a idade e com a doença de Alzheimer no que diz respeito à densidade da APP e das secretases. Este projeto constitui o primeiro passo para a compreensão da particular susceptibilidade para a disfunção e degeneração de sinapses glutamatérgicas e GABAérgicas, em etapas iniciais da doença de Alzheimer, e pode vir a ser útil para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
Author: Anna Pliássova
Language: English
Subfield: Cellular and Molecular Neuroscience
Field: Neuroscience
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2625007576