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Untersuchungen zum Einfluss der Zytokine CD40L, BAFF, IL10 und IL21 auf Proliferation, Überleben und Phänotypänderungen von B-Zellen des Haushuhns in vitro

Year: 2017
Type: dissertation
Abstract: Ziel dieser Arbeit war es, das aus der Säuger-B-Zellentwicklung bekannte, potente Zytokin IL21 in Kombination mit CD40L, BAFF und IL10 zur Stimulation von Hühner-B-Zellen aus Bursa und Milz einzusetzen und deren Effekte auf Proliferation, Überleben und phänotypische Änderungen in der Expression wichtiger Oberflächenmoleküle zu untersuchen. Die Proliferation betreffend, hatten in beiden Organen weder IL10 noch IL21 alleine einen Effekt. Der Zusatz von BAFF führte zu einer geringfügigen, CD40L zu einer stärkeren Erhöhung der Proliferationsrate. Während IL10 und IL21 einen deutlichen Synergismus mit CD40L und eine extrem hohe 3H-Thymidin-Aufnahme zeigten, bewirkte die Kombination CD40L+BAFF keine weitere Steigerung der Proliferation. Die maximale Proliferation wurde in der Bursa nur durch CD40L+IL21 erzielt. In Milzzellkulturen gelang dies dagegen sowohl durch CD40L+IL21 als auch durch CD40L+IL10. Interessanterweise konnte ein, wenn im Vergleich zu CD40L auch schwächerer, Synergismus zwischen BAFF und IL21 in B-Zellen aus Bursa- und Milz nachgewiesen werden. Da BAFF und CD40L gemeinsame Teilschritte der NFκB-Signalkaskade aktivieren, scheint BAFF hier als abgeschwächter Ersatz für das CD40-Signaling zu dienen. Mit Hilfe des Proliferationsfarbstoffes eFluor670 wurde nachgewiesen, dass in gemischten Lymphozytenpopulationen der Milz durch die verwendeten Zytokine fast ausschließlich B-Zellen zur Proliferation angeregt wurden und sich in Ansätzen mit CD40L+IL10 und CD40L+IL21 annähernd 100 % der B-Zellen geteilt haben. Die Anzahl lebender B-Zellen war in den Stimulationen mit hohen Proliferationsraten am größten. Aber auch BAFF war in der Lage, die Anzahl lebender B-Zellen zu steigern und zeigte dabei einen größeren Effekt auf die immaturen B-Zellen der Bursa. Durch Vergleich des Lebend-Tot-Index mit dem Proliferationsindex fiel auf, dass auf Bursalymphozyten die Zytokin-induzierte Proliferation bei weitem überwog. In Milzlymphozyten war dagegen der Lebend-Tot-Index für alle Stimulationen entweder gleich dem Proliferationsindex bzw. überstieg diesen für die Kombination aus CD40L+BAFF+IL21+IL10 sogar deutlich. Während die Zytokine folglich in den immaturen B-Zellen aus der Bursa massiv Proliferation induzieren, die Zellen aber auch sehr rasch absterben lassen, führen die gleichen Stimuli in den weiter differenzierten, maturen B-Zellen aus der Milz nicht nur zur Proliferation, sondern erhöhen auch ihre Überlebensrate. Zusammenfassung 82 Die durchflusszytometrischen Färbungen zeigten, dass durch die Stimulation mit den ausgewählten Zytokinkombinationen die Expression von B-Zell-Rezeptor, Zytokinrezeptoren (CD40, BAFF-R), Aktivierungsmarkern (CD80, MHCII) und Chemokinrezeptoren (CXCR4, CXCR5) stark verändert wurde, wobei sich auch hier deutliche Unterschiede zwischen kultivierten Bursa- und Milzlymphozyten zeigten. Bei den B-Zellen aus der Bursa führte alleine die Kultivierung in Medium zu einer deutlichen Aktivierung und verstärkten Expression aller untersuchten Oberflächenproteine, besonders deutlich war dies für CXCR4. Dieser Effekt wurde auch durch die Zugabe von BAFF, IL10 oder IL21 kaum beeinflusst. Alle Stimulationen, die CD40L enthielten, führten jedoch zu einer weiteren Erhöhung der Expression von B-Zellrezeptor und MHCII, einem Phänotyp, der in vivo den aus der Bursa emigrierenden Zellen entspricht. Die Kombination CD40L+IL21 verminderte außerdem die Expression von CXCR5, was eine Voraussetzung für die Emigration darstellen könnte. Die Phänotypisierung der stimulierten Milz-B-Zellen ergab dagegen ein deutlich heterogeneres Bild. So führte die Kultivierung in Medium alleine zu keiner erhöhten Expression von CD80 und MHCII, die Expression des B-Zellrezeptors wurde sogar halbiert. Wie in Bursazellen wurde aber auch hier eine extrem starke Induktion von CXCR4 beobachtet. BAFF, IL10 und IL21 alleine wiesen eine z.T. verstärkende, z.T. inhibierende Funktion auf die Expression der Marker auf. Die Kombinationen mit CD40L führten zu einer starken Induktion von CD80 und MHCII. Die Expression von Bu1, einem Hühner spezifischen B-Zellmarker, der im Verlauf der Differenzierung zur Plasmazelle langsam verloren geht, war vor allem in der Kombination aus CD40L+IL21 stark reduziert. Auffällig war in den Milzzellkulturen außerdem, dass durch mehrere Stimulationen für die Aktivierungsmarker, CD40, BAFF-R und den B-Zellrezeptor eine kleine Subpopulation mit sehr niedriger Expression entstand, deren Funktion noch geklärt werden muss. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es gelungen ist, durch die Stimulation mit synergistisch wirkenden Zytokinen in Bursalymphozyten einen hoch proliferativen, aktivierten Zustand ähnlich der Situation in vivo im Follikelcortex zu induzieren. B-Zellen aus der Milz konnten ebenfalls stark zur Proliferation angeregt werden, wie es in vivo bei Bildung von Germinalen Zentren vorkäme, und zeigten phänotypisch eine weitergehende Differenzierung in Richtung von Plasmablasten mit der Entstehung von zusätzlichen Subpopulationen. So zeigt die vorliegende Arbeit, dass die gleichen Zytokin-Signale in der B-Zelldifferenzierung in Bursa und Milz unterschiedliche zelluläre Reaktionen induzieren.
DOI: 10.5282/edoc.21168
Language: German
Subfield: Immunology
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2762037289
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