Quantitative Kinetic Analyses of Histone Turnover Using Imaging and Flow Cytometry
Year: 2020
Type: article
Abstract: Dynamic histone changes occur as a central part of chromatin regulation. Deposition of histone variants and post-translational modifications of histones are strongly associated with properties of chromatin status. Characterizing the kinetics of histone variants allows important insights into transcription regulation, chromatin maintenance and other chromatin properties. Here we provide a protocol of quantitative and sensitive approaches to test the timing of incorporation and dissociation of histones using a two-color SNAP-labeling system, labelling pre-existing and newly-incorporated histones distinctly. Together with cell cycle synchronization methods and cell cycle markers, this approach enables a pulse-chase analysis to determine the turnover of histone variants during the cell cycle, detected using imaging or flow cytometry methods at single cell resolution. As well as testing global histone turnover, cell cycle-dependent cellular localization of histone variants can be also addressed using imaging approaches., [摘要] 动态的组蛋白变化是染色质调节的核心部分。组蛋白变体的沉积和组蛋白的翻译后修饰与染色质状态的属性密切相关。表征组蛋白变体的动力学特性可为深入了解转录调控，染色质维持和其他染色质特性提供重要信息。在这里，我们提供了一种定量和敏感方法的协议，以使用双色SNAP标记系统测试组蛋白的结合和解离时间，分别标记预先存在的和新结合的组蛋白。结合细胞周期同步方法和细胞周期标志物，这种方法可以进行脉冲追踪分析，以确定在细胞周期内使用成像或流式细胞仪方法以单细胞分辨率检测到的组蛋白变体的周转率。除了测试整体组蛋白更新，还可以使用成像方法解决组蛋白变体的细胞周期依赖性细胞定位。[背景] 染色质重塑是真核细胞众多基本细胞活动的一部分（Geiman 和Robertson，2002；Clapier 和Cairns ，2009）。转录因子和RNA聚合酶的可及性通常与DNA甲基化和染色质状态的变化相关，包括可及性，翻译后的组蛋白修饰和组蛋白变体的沉积。组蛋白变体差异性地调节调节发育，细胞分化或其他生理活动的基因表达（Banaszynski 等，2010）。它们在DNA修复，端粒维护，异染色质形成和染色质分离中也发挥着不同的作用（Henikoff 和Smith，2015； Zink和Hake，2016）。此外，组蛋白变体的掺入失调与癌症有关（Vardabasso et al。，2014），表明其在人类疾病中的重要作用。了解组蛋白变体的动力学，包括在细胞周期中掺入特定的染色质区域或从中分离，是至关重要的，因为它将调节特性与表观遗传的有丝分裂维持紧密联系在一起（从亲代细胞到子代细胞的遗传力）。DNA复制涉及主要的染色质重塑，以在有丝分裂后复制整个染色质结构。在DNA复制之前与染色质相关的组蛋白通过DNA聚合酶复合物的进入而从DNA瞬时解离。新合成的复制叉与新合成的组蛋白一起随机重新释放先前存在的组蛋白（Balhorn 等，1975；Alabert 和Groth ，2012；Annunziato ，2012）。组蛋白和某些组蛋白变体的预先存在的翻译后修饰也在复制叉处重新与新合成的DNA结合，这说明复制叉处预先存在的组蛋白的重新结合是维持有丝分裂遗传的一部分。染色质状态。为了确定翻译后修饰或组蛋白变体掺入的时间，需要一种灵敏的脉冲追踪系统，该系统可以将新掺入的组蛋白的检测与先前存在的组蛋白区分开。当新合成的规范组蛋白在DNA复制过程中被整合到染色质中时，它们不会被修饰。与DNA复制同时发生的从头DNA甲基化不同（Tillo 等人，2016），大多数组蛋白标记未在复制叉上新掺入的组蛋白上建立。基于蛋白质组学的脉冲追踪方法（请参见下面的替代方法部分）已用于通过检测赖氨酸残基上已存在和新沉积的组蛋白乙酰化和甲基化来确定组蛋白翻译后修饰的整体动力学（Pesavento 等。，2008； Scharf 等，2009； Martinez-Garcia 等，2011； Xu 等，2011； Zee 等，2012；Alabert 等，2015）。这种方法确定了组蛋白修饰的两个独特的动力学模式。一组，例如在27（H3 K27 ac）处的组蛋白H3乙酰赖氨酸，表现出快速的周转以平衡，并且值得注意的是，它们在整个细胞周期中都没有得到维持（Scharf et al。，2009）。这种快速的乙酰化动力学可能代表了暂时活跃的转录动力学（Stasevich et al。，2014）。而包括在图9（K9me3）H3赖氨酸三甲基化或H3 K27me3另一组是在细胞周期的代替以下更缓慢地获取并逐步从单和二到三甲基化，建立期间G1期有丝分裂之前（Pesavento 等人。，2008;沙尔夫等人，2009; Martinez的加西亚。等人，2011;徐。等人，2011; Zee的。等人，2012; Alabert 。等人，2015） 。重要的是，该组具有有丝分裂染色体记忆的特性。通过成像方法已经解决了在细胞分裂过程中维持组蛋白标记的潜在机制。原位 使用抗组蛋白赖氨酸甲基化的特异性抗体及其甲基转移酶进行的近距离连接测定法检测到，组蛋白修饰剂与果蝇胚胎中复制的DNA成分连续缔合，表明复制DNA上修饰剂的缔合可能提供了被甲基化的`` 标签'' （Petruk 等。，2012）。 化学蛋白质标记技术的最新进展为我们提供了一种在活细胞中进行蛋白质标记应用的强大工具（例如SNAP（新英格兰生物实验室），CLIP（新英格兰生物实验室），Halo（普罗mega）和TMP（活性母体）标签）。这些技术基于与与细胞渗透性底物（例如合成荧光染料或生物素）缀合的特定配体结合的遗传编码标签的共价标记，可以在生化应用中介导亲和纯化。与常见的遗传编码标签相反，蛋白质的这种化学标记可用于具有多种荧光团选择的时序依赖性标记中，从而可以对特定蛋白质进行脉冲追踪标记。这项标记技术通过成像检测（例如，着丝粒处的CENP-A [Dunleavy 等，2009 ] 和异染色质处的macroH2A [ Sato 等，2019 ] ）揭示了特定染色质结构上组蛋白变体的沉积时间。 在这里，我们提供了使用SNAP标签标记系统的脉冲追踪方法的详细协议，该系统利用了具有单细胞分辨率的定量组蛋白变异检测。使用此协议，可以同时检测到不同的组蛋白动力学，既有组蛋白的解离和新合成的组蛋白的缔合。我们描述了两种检测方法，荧光显微镜和流式细胞仪，以及使用FIJI / ImageJ软件（免费提供）的成像分析的详细信息（https://fiji.sc/）。 优点和局限性与使用放射性分子的常规脉冲追踪方法相比，使用化学蛋白质标记系统的脉冲追踪方法是一种简单，无危险且敏感的方法（请参阅替代方法部分）。大多数所需的试剂和荧光团是可商购的。可以使用成像和流式细胞仪应用解决组蛋白的全球营业额，特别是，特定的染色质结构上的时序特异性定位也可以通过成像方法来表征。使用此协议，可以在同一细胞中以单个细胞分辨率同时检测既存的和新合并的组蛋白变体。与检测内源性组蛋白的放射性同位素或代谢标记方法不同，此标记方法依赖于可以与特定底物相连的遗传编码标签（例如SNAP-，CLIP-，Halo标签）。因此，需要表达具有SNAP标签的靶组蛋白的质粒构建体及其在稳定表达的细胞系中的用途。另外，必须检查所需标签组蛋白的定位和其他生物学功能，以确定其是否仍起内源性组蛋白的作用。为了获得准确的观察结果，可能需要优化构建体（例如，N末端或C末端标记，更改启动子的选择）和表达水平。该方法的另一个局限性在于它不适用于检测组蛋白的翻译后修饰。 替代方法蛋白质组学检测同位素标记SILAC（稳定的同位素在文化中用氨基酸标记），然后进行质谱分析是研究内源性组蛋白变体和翻译后修饰的全球营业额的有力方法（Yuan 等人，2014 ）。在这种方法中，新合成的组蛋白被放射性重同位素标记，与已存在的含轻氨基酸的组蛋白相比，追踪了被标记的组蛋白的转换。质谱分析后确定翻译后修饰或变体的预先存在和沉积。这种方法适用于检测整体组蛋白更新，但不能检测特定染色质结构或基因组位点处的组蛋白标记。 全基因组方法的代谢标记新生蛋白质的非放射性代谢标记可以是标记全局新合成的组蛋白的替代方法。也称为“ CATCH-IT”的方法“将标签共价附着以捕获组蛋白和识别周转率”，可以进行全基因组研究以表征活性组蛋白置换（Deal 等，2010）。此方法基于通过结合蛋氨酸同系物叠氮高丙氨酸（Aha）来新生肽的标记方案，该方法通常用于检测细胞中的活性翻译。在这种方法中，将含有Aha标记的新合成组蛋白的核小体通过环加成反应（称为“喀哒”化学）与生物素生物缀合，并用抗生蛋白链菌素珠粒拉下。将来自下拉的分离的DNA 应用于平铺微阵列，以确定在果蝇S2细胞中表现出活性组蛋白置换的基因组位点。具有活性组蛋白更新的特征基因组位点与组蛋白H3变体H3.3的掺入位点相对应，该位点在转录活性位点被检测到（Henikoff 等，2009）。这种方法能够检测具有组蛋白活跃更新的基因组位点。 化学标记方法（例如SNAP标记系统）也可以是研究全基因组组蛋白变体掺入的替代选择（Sato 等人，2019）。在这种方法中，新组成SNAP标签组蛋白与SNAP-生物素治疗SNAP-细胞后联® 块（bromothenylpteridine ，BTP），非荧光底物，以掩盖预先存在的组蛋白的反应性。然后，可以用抗生蛋白链菌素珠将生物素连接的新结合的组蛋白拉下来。从下拉样品中纯化的DNA片段可通过大规模平行测序进行测序。该方法对于检测组蛋白变体的时间和基因组基因座依赖性掺入但不能检测翻译后修饰可能是有用的。
Source: BIO-PROTOCOL
Authors: Hanae Sato, Robert Singer, John Greally
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W3083729404