Isolation and ex vivo Expansion of Human Limbal Epithelial Progenitor Cells
Year: 2020
Type: article
Abstract: Limbal stem cell transplantation has been used successfully to treat patients with limbal stem cell deficiency all over the world. However, long term clinical results often proved less satisfactory due to the low quality of the graft or inadequate properties of transplanted cells. To enhance the ex vivo expansion of human limbal epithelial stem or progenitor cells (LEPC) by preserving stem cell phenotype and to improve subsequent transplantation efficiency, cell-matrix interactions ex vivo should mimic the condition in vivo. The laminin isoforms preferentially expressed in the limbal niche can be used as a culture matrix for epithelial tissue engineering. We recently published the expansion of LEPC on various laminin isoforms and observed that laminin alpha 5-derived matrices support the efficient expansion of LEPC compared to tissue culture plates and other laminin isoforms by preserving stem/progenitor cell phenotype. Here, we describe an optimized protocol for the isolation of LEPC from cadaveric corneal limbal tissue by collagenase digestion and efficient expansion of LEPC using recombinant human laminin-511 E8 fragment (LN-511E8) as culture substrate., [摘要] 角膜缘干细胞移植已成功用于治疗角膜缘干细胞缺乏症的患者。但是，由于移植物质量低或移植细胞特性不足，长期临床结果常常不能令人满意。为了通过保留干细胞表型来增强人角膜缘上皮干细胞或祖细胞（LEPC）的体外扩增，并提高后续移植效率，离体细胞-基质相互作用应模拟体内条件。在角膜缘利基中优先表达的层粘连蛋白同工型可以用作上皮组织工程的培养基质。我们最近发表了LEPC在各种层粘连蛋白同工型上的扩增，并观察到与组织培养板和其他层粘连蛋白同工型相比，层粘连蛋白α5衍生的基质通过保留干/祖细胞表型，支持LEPC的有效扩增。在这里，我们描述了通过重组人层粘连蛋白-511 E8片段（LN-511E8）作为培养底物，通过胶原酶消化和LEPC的有效扩增从尸体角膜缘组织分离LEPC的优化方案。[背景] 角膜上皮干/祖细胞（LEPC）负责角膜上皮的持续更新，位于高度专业化和复杂的环境中。它包括特定的细胞外基质组分和在支撑角膜缘细胞小生corneo -scleral缘（Schermer 等人，1986; Cotsarelis 。等人，1989; 奥多涅斯。等人，2012 ;梅。等人，2012）。这种干/祖细胞储库的损坏或损伤可导致角膜新生血管形成，慢性炎症和与角膜混浊和视力丧失相关的基质瘢痕形成（Kenyon和Tseng，1989； Sangwan 和Tseng ，2001；Dua 等，2010）。 。培养的角膜缘上皮移植（CLET）已在各种临床中心用作治疗方法，据报道，对于随访至少24个月的单侧病例，自体CLET的总体成功率达72-76％（ Rama 等，2010； Tsai 等，2010；Utheim 等，2013； Holland 等，2015）。在双侧的情况下，同种异体中央穿透性角膜缘角膜成形术联合结膜成形术，丝裂霉素C和羊膜移植术后34个月的随访显示成功率为70％（Eberwein 等人，2012）。然而，长期角膜再生常常被证明不太令人满意。这可能是由移植物的低质量或移植祖细胞的性质不足引起的（大亚等人，2005;拉姆一个等人，2010; 佩莱格里尼。等人，2014 ;中村等人，2016）。这些局限性强调了对开发新型标准化LEPC培养技术的需求，该技术可确保在培养过程中和移植后保留干细胞/祖细胞的表型和功能。 层粘连蛋白（LN）是存在于成体干细胞壁ni（包括角膜缘干细胞利基）的基底膜（BM）中的特征最丰富的细胞外基质成分，它们会影响细胞行为，例如细胞粘附，分化和表型稳定性。各种报道显示眼表上皮的BM中LN同种型表达的异质性。特别是LN链α 5，β 1，β 2，和γ 1优先定位于角膜缘上皮细胞的BM相比于角膜上皮的（Ljubimov 等人，1995; Schlötzer-Schrehardt 等人，2007; Polisetti 等人，2017）（图1）。我们之前已经报道过，含LNα5的同工型以及人LN-511的生物活性片段（LN-511 E8）支持LEPC的有效离体扩增（Polisetti 等，2017）。图1.层粘连蛋白链在角膜缘干细胞原位的表达。一。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）引物分析显示层粘连蛋白α2（LAMA2），α4（LAMA4），α5（LAMA5），β2（LAMB2），β3（LAMB3）和γ2（LAMC2）的表达水平较高与基底角膜上皮细胞（BCEC）群体相比，在显微解剖的角膜缘上皮干/祖细胞（LEPC）簇中；层粘连蛋白α1（LAMA1），α3（LAMA3），β1（LAMB1），β4（LAMB4），γ1（LAMC1）没有差异表达模式。乙。角膜巩膜组织切片的免疫荧光分析显示层粘连蛋白α2，α5，β2，β3，γ2 和γ3的染色方式不同，但在角膜和角膜缘上皮的基底膜中层粘连蛋白α1，α3，β1 和γ1的染色方式相似; 层粘连蛋白α4 在上皮基底膜中大部分为阴性。Ç 。层粘连蛋白（LN）α5（绿色）和细胞角蛋白（CK）15，N-钙黏着蛋白，p63α ，整联蛋白α6，整联蛋白α3 和整联蛋白β1（红色）的免疫荧光双标记; 用DAPI进行核染色（蓝色）；比例尺 = 20 µm。转载自Polisetti 等。，2017年，根据CC BY 4.0许可。 在这里，我们提出了用于LEPC隔离和扩展的优化协议。隔离协议类似于Chen 等提供的协议。（2011年）的修改很少，但我们在LN-511E8包被的板上扩展了LEPC，以改善干/祖细胞表型的增殖和保存（Polisetti 等，2017）。
Source: BIO-PROTOCOL
Language: English
Subfield: Radiology, Nuclear Medicine and Imaging
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: hybrid
OpenAlex ID: W3087518491