Work

Affinity Purification of GO-Matryoshka Biosensors from E. coli for Quantitative Ratiometric Fluorescence Analyses

Year: 2020

Type: article

Abstract: Genetically encoded biosensors are powerful tools for quantitative visualization of ions and metabolites in vivo. Design and optimization of such biosensors typically require analyses of large numbers of variants. Sensor properties determined in vitro such as substrate specificity, affinity, response range, dynamic range, and signal-to-noise ratio are important for evaluating in vivo data. This protocol provides a robust methodology for in vitro binding assays of newly designed sensors. Here we present a detailed protocol for purification and in vitro characterization of genetically encoded sensors, exemplified for the His affinity-tagged GO-(Green-Orange) MatryoshCaMP6s calcium sensor. GO-Matryoshka sensors are based on single-step insertion of a cassette containing two nested fluorescent proteins, circularly permutated fluorescent green FP (cpGFP) and Large Stoke Shift LSSmOrange, within the binding protein of interest, producing ratiometric sensors that exploit the analyte-triggered change in fluorescence of a cpGFP., [摘要]遗传编码的生物传感器是强大的工具为离子和代谢物的定量可视化在体内。设计和优化此类生物传感器通常需要分析大量变体。体外确定的传感器特性，例如底物特异性，亲和力，响应范围，动态范围和信噪比，对于评估体内数据很重要。该协议为新设计的传感器的体外结合测定提供了可靠的方法。这里我们提出了一个详细的协议用于纯化和体外表征的遗传编码的传感器，例示的His亲和标记的GO-（绿橙色）MatryoshCaMP6s钙传感器。GO-Matryoshka传感器基于在感兴趣的结合蛋白内一步插入一个包含两个嵌套荧光蛋白，圆形排列的荧光绿色FP（cpGFP ）和Large Stoke Shift LSSmOrange的盒的方法，从而产生了利用被分析物触发的比例式传感器cpGFP的荧光变化。[背景技术]将绿色荧光蛋白（GFP）在1962年被鉴定在水母水母维多利亚（下村等人，1962）。30年后，描述了其首次用作报道基因（Chalfie等，1994）。自从发现以来，GFP变体和其他荧光蛋白为生物科学的主要进步做出了巨大贡献，并且现在已成为生物医学研究中的常用工具（Frommer等，2009）。各种荧光蛋白（FP）和FP变异体已被用作报道分子或与所有生命王国的生物体中的蛋白融合（Chudakov等，2010 ；Valeur和Berberan- Santos，2012 ）。不断地，已经鉴定出或正在设计具有增强特性的新型荧光蛋白，从而进一步改进和扩展了用于可视化体内过程的工具包。这些新颖的荧光团使我们能够监控各种各样的实时过程，从细胞的结构组织到活生物体的动态过程。可光活化的FP已经成功地用于追踪时空中的分子和细胞（Misteli和Spector，1997 ；March等，2003 ）。最近，FP启用了生物传感器的设计。通常使用不同类别的基因编码生物传感器，包括基于单个荧光团强度的传感器和基于Förster共振能量转移（FRET）的两个荧光团传感器（Frommer等，2009）。在同一个单元格中使用了多种方法来执行多重传感器分析（Mehta et al。，2018）。传感器操作的机制可以依赖于FP自身的修饰，以响应其与配体的相互作用（如分别在pHluorin或Clomeleon中用于质子和氯化物）（Miesenbock等，1998；Kuner和Augustine，2000）。或者，可将FPs移植到配体结合域上。配体结合触发构象重排，其影响荧光性质或荧光团的相对位置（Deuschle等，2006；Kaper等，2008）。如今，遗传编码的生物传感器广泛用于体内监测离子和代谢物的水平和动态，转运蛋白的活性或张力（Frommer等，2009）。尽管成功使用了依赖于一对供体和受体FP相对位置变化而导致的荧光比率变化的生物传感器，但许多第一代传感器都受到其相对较低的动态范围和信噪比的限制[SNR；有关动态范围和SNR的定义，请参见Perez Koldenkova和Nagai（2013）。某些涉及使用构象敏感FP（csFP ）的先进的单个荧光团强度生物传感器，可以具有令人印象深刻的高动态范围和高SNR。然而，生物传感器的表达水平的变化将影响读数，引起对体内使用的可靠性和伪像的担忧。体内测量的实际适用性需要比较目标组织中不同传感器的变体（Perez Koldenkova和Nagai，2013）。然而，这种传感器的体外特性是重要的信息，包括关于亲和力以及在诸如动作电位的快速过程中的动力学的定量信息。为了避免伪像，可以通过将csFP与参考FP耦合将强度传感器转换为比率传感器。最近，一种名为Matryoshka的新技术提供了一个通用平台，以创建双FP生物传感器，该传感器具有大的动态范围，在广泛的pH和缓冲条件下都具有良好的稳定性，并且由于使用了大Stokes移位而获得了单波长激发（LSS）FP （Ast等人，2017）。将这种参考FP（例如，LSSmOrange ）嵌套在报道分子FP（例如，圆形排列的绿色FP）内，允许在单个激发波长下激发两个FP。该技术已成功应用于分别生成胞质钙和铵转运传感器，GO- MatryoshCaMP和AmTryoshka变体（Ast等人，2017）。在这里，我们提出了从大肠杆菌K12的遗传编码His标记的Matryoshka生物传感器的体外结合测定纯化和表征的详细协议。这里介绍的协议是专门为GO-MatryoshCaMP6的纯化和表征而开发的，但可以更广泛地用于其他具有轻微修饰的荧光生物传感器。

Source: BIO-PROTOCOL

DOI: 10.21769/bioprotoc.3773