Quantitative Characterization of the Amount and Length of (1,3)-β-D-glucan for Functional and Mechanistic Analysis of Fungal (1,3)-β-D-glucan Synthase
Year: 2021
Type: article
Abstract: (1,3)-β-d-Glucan synthase (GS) is an essential enzyme for fungal cell wall biosynthesis that catalyzes the synthesis of (1,3)-β-d-glucan, a major and vital component of the cell wall. GS is a proven target of antifungal antibiotics including FDA-approved echinocandin derivatives; however, the function and mechanism of GS remain largely uncharacterized due to the absence of informative activity assays. Previously, a radioactive assay and reducing end modification have been used to characterize GS activity. The radioactive assay determines only the total amount of glucan formed through glucose incorporation and does not report the length of the polymers produced. The glucan length has been characterized by reducing end modification, but this method is unsuitable for mechanistic studies due to the very high detection limit of millimolar amounts and the labor intensiveness of the technique. Consequently, fundamental aspects of GS catalysis, such as the polymer length specificity, remain ambiguous. We have developed a size exclusion chromatography (SEC)-based method that allows detailed functional and mechanistic characterization of GS. The approach harnesses the pH-dependent solubility of (1,3)-β-d-glucan, where (1,3)-β-d-glucan forms water-soluble random coils under basic pH conditions, and can be analyzed by SEC using pulsed amperometric detection (PAD) and radioactivity counting (RC). This approach allows quantitative characterization of the total amount and length of glucan produced by GS with minimal workup and a d-glucose (Glc) detection limit of ~100 pmol. Consequently, this approach was successfully used for the kinetic characterization of GS, providing the first detailed mechanistic insight into GS catalysis. Due to its sensitivity, the assay is applicable to the characterization of GS from any fungi and can be adapted to study other polysaccharide synthases., [摘要] （1,3）-β- d葡聚糖合成酶（GS）是一个必不可少的真菌细胞壁的生物合成，其催化（1,3）-β-合成酶d葡聚糖，一个重要的和关键的成分细胞壁。GS是包括FDA批准的棘皮菌素衍生物在内的抗真菌抗生素的可靠靶点；ħ H但是，功能和GS的机制在很大程度上仍然未表征由于缺少信息活性测定的小号 。以前，放射性分析和还原末端修饰已用于表征GS活性。放射性测定仅确定通过葡萄糖掺入形成的葡聚糖的总量，并且没有报告所产生的聚合物的长度。葡聚糖长度的特点是还原端修饰，但第是方法不适用于机理研究由于毫摩尔的非常高的检测限AR量和技术的劳动密集。因此，GS催化的基本方面，例如聚合物长度特异性，仍然是模棱两可的。我们已经开发了一种基于尺寸排阻色谱（SEC）的方法，该方法可以对GS进行详细的功能和机理表征。该方法利用了（1,3）-β- d-葡聚糖的pH依赖性溶解度，其中（1,3）-β- d-葡聚糖在碱性pH条件下形成水溶性无规卷曲，可以通过SEC分析使用脉冲安培检测（PAD）和放射性计数（RC）。这种方法允许通过GS以最小的后处理和产生的葡聚糖的总量和长度的定量表征一个d -葡萄糖（GLC）检测限的〜100pmol的。因此，成功使用这种方法的GS的运动特性，provid荷兰国际集团首次详细机械洞察GS催化作用。因其敏感性，该试验是适用于所述characteriz的通货膨胀从任何真菌GS和可以适于研究其他多糖合酶。[背景]多糖的表征是我们的各种生物过程的理解基本，如细菌，真菌细胞壁生物合成，和植物，由微生物生物膜的形成，和细胞外基质的在人类中的形成。尽管可以使用多种方法（包括薄层色谱法，高效液相色谱法和质谱法）对短而可溶性的寡糖进行表征，但是在表征长的，生物学相关的聚合物方面仍然存在重大的技术挑战。结果，关于大多糖的生物合成的大小和机理的分子细节仍然是未知的。在过去的二十年中，已经开发出许多方法来研究带电荷的和水溶性的多糖。例如，乙酰透明质酸已通过纸层析（Tlapak-Simmons等，2005 ）或电泳（Krupa等，2007 ）进行了表征，细菌肽聚糖的电泳已得到了表征（Barrett等，2007 ）。^ h H但是，一些方法可用于的电中性和水不溶性多糖的表征。在这些多糖中，（1,3）-β- d-葡聚糖是真菌细胞壁的重要结构成分（Munro，2013 ），其生物合成酶是（1,3）-β- d-葡聚糖合酶（GS） ），是FDA的一个行之有效的目标-批准抗真菌抗生素（道格拉斯，2001年）。因此，表征的催化和抑制机制GS是势在必行理解真菌细胞壁生物合成和作用和抗GS-目标的机制编抗真菌药。然而，尽管GS活性公顷咏自80年代以来，已知（Shematek等人，1980 ），详述机械表征一直不可能由于缺乏适当的方法进行定量评价的数量和长度（1,3）-β - ð葡聚糖。因此，这种酶的许多基本方面，例如产物长度特异性，仍然是模棱两可的。GS已被使用放射性测定法，其特征在于（Shematek等人，1980年）该孔定量TAT电子商务不溶于水的总量（1,3）-β- d葡聚糖通过确定掺入的量d -葡萄糖（GLC）。尽管该方法确定了GS的总体活性，但并未揭示聚合物产物的长度。GS产品的长度已被使用还原端修饰，其特征在于（Shematek等人，1980 ），其中还原性的（1,3）端-β- d葡聚糖我和s还原为山梨醇的聚合物水解成单糖。接着，长度我根据GLC和山梨糖醇之间的比率S确定。该分析表明小号其的平均长度（1,3）-β- d葡聚糖通过GS在粗膜标本制作我第60 - 80聚体（Shematek等人，1980 ）; ħ H但是，这种方法需要大量的（1,3）-β- d葡聚糖，通常以毫摩尔AR quantit IES 。此外，c中的方法的低估的长度通过切割通过后处理或纯化过程中的剥离或反应的其它机制（刹帝利等人，2020 ）; 吨herefore，当前存在对GS的详细机械特性没有合适的方法。最近，尺寸排阻色谱法（SEC）已被用来表征水不溶性多糖的长度。^ h H但是，色谱条件和检测方法往往限制其U SE的详细机理研究。例如，使用放射线作为检测方法，用一氯乙酸将氧甲基甲基化后，通过SEC对真菌细胞壁葡聚糖和几丁质进行了分析（Cabib和Duran，2005； Cabib，2009 ）。这种化学衍生作用可溶解否则不溶于水的葡聚糖和几丁质，并允许使用水性溶剂进行SEC分析。然而，由于衍生是不定量的，聚合物的绝对长度没有测定，和葡聚糖仅相对长度-和壳多糖的含测定分离的细胞壁（Cabib等人，2012 ）。SEC也已用于表征细菌纤维素合酶。在这种情况下，纤维素在溶解了二甲基乙酰胺的含8％的LiCl（W / V）和由耦合凝胶渗透色谱法分析，以多角度光散射（GPC-MALS） （麦克马纳斯等人，2018 ）。这种方法避免了化学衍生化的陷阱，并可能适用于许多其他多糖。然而，该长度仅酶催化的稳态下测定和伸长的纤维素聚合物是不可检测的，这可能是由于有限的灵敏度折射率检测。在这里，我们报告用于在氢氧化钠水溶液中使用SEC的脉冲安培检测（PAD）和放射性计数（RC）来确定（1,3）-β- d-葡聚糖的量和长度的方案。该协议克服上述的限制：PAD和RC允许适当的在灵敏度的长度和葡聚糖聚合物的分布的表征的GS的机械特性，并且使用氢氧化钠水溶液作为溶剂允许的增溶的否则不溶于水的（ 1,3）-β- d-葡聚糖。这种方法（约100皮摩尔）的检测极限是更大的数量级，比四个数量低于减少先前对（1,3）报道端改性-β- d葡聚糖characterizati上。该测定法的一个重要限制是它需要相当纯的GS。迄今为止，该方法不与粗膜部分工作小号由于扰乱的葡聚糖迁移蛋白的存在通过SEC柱。因此，在该协议中，我们描述了使用产物包埋法和SEC测定法制备部分纯化的GS的方法。产物截留后得到的GS在SDS-PAGE上的纯度为20 ％至30％，比活度约为1,000 nmol / min / mg。虽然我们的表征表明小号，在这种制剂中的杂质不影响GS（无论是葡聚糖长度或动力学）的表观功能（刹帝利等人，2020 ），它我的批判通过洗涤用SDS以除去从葡聚糖样品的蛋白质。该协议已经被用于研究GS催化机制和成功地检测到（1,3）-β- d 〜1000之间葡聚糖伸长和〜8000聚体在超过40年的在第一时间- GS的很长的历史（Chhetri等人，2020年）。简便的链长测定也与封闭的底物类似物偶联以明确确定聚合方向，这是多糖生物合成中关键但具有挑战性的机械问题之一（Chhetri等人，2020 ）。这些应用证明了基于SEC的GS活性测定的重要性。可以采用类似的方法来研究其他多糖合酶（如糖原和透明质酸合酶）的活性。
Source: BIO-PROTOCOL
Institutions: Duke University, Duke Medical Center
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W3155208687