Year: 2011
Type: dissertation
Abstract: Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Quantifizierung von Zelladhäsion vermittelnden Liganden in und auf dünnen Hydrogelschichten, die zur Oberflächenmodifizierung auf Biomaterialien aufgebracht wurden. Das bereits etablierte und gut charakterisierte inerte NCO-sP(EO-stat-PO) Hydrogelsystem, das eine einfache und reproduzierbare Bioaktivierung mit Peptiden erlaubt, wurde als Basis für diese Arbeit verwendet. Diese Hydrogele können auf zwei Weisen funktionalisiert werden. Liganden können entweder mit der Prepolymerlösung vor der Beschichtung gemischt (Einmischmethode) oder frische Hydrogelschichten mit einer Ligandenlösung inkubiert werden (Inkubationsmethode). Der erste Teil dieser in drei Hauptteile unterteilten Arbeit, beschäftigte sich mit der Konzentrationsbestimmung der Liganden in der gesamten Tiefe der Hydrogelschicht, während sich der zweite Teil auf die oberflächensensitive Quantifizierung von Zelladhäsion vermittelnden Molekülen an der biologischen Grenzfläche konzentrierte. Die Ergebnisse wurden mit Zelladhäsionskinetiken verglichen. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen als auch strukturellen Nachahmung der komplexen Extrazellulärmatrix (ECM). Das ECM Protein Fibronektin (FN) wurde über Zucker-Lektin Anbindung präsentiert und Zellverhalten auf diesen biomimetischen Oberflächen untersucht. Ebenfalls wurde Zellverhalten in einer dreidimensionalen Faserumgebung mit identischer Oberflächenchemie wie in den beiden ersten Teilen dieser Arbeit untersucht und mit der Peptidkonzentration korreliert. Insgesamt, war die Hauptfragestellung in dieser Arbeit ‘Wie viel?’, d.h. einerseits die Ermittlung der maximalen, als auch der für Zelladhäsion optimalen Ligandendichte. Im ersten praktischen Teil der vorliegenden Arbeit (Klassische Quantifizierung) wurden Liganden in der gesamten Hydrogelschicht, als auch speziell in oberen Bereichen der Schichten quantifiziert. Die Untersuchung der Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas funktionalisiert mit GRGDS und 125I-YRGDS erfolgte in Kapitel 3 mittels Radioaktivmessung. Wurden Hydrogelschichten mittels Inkubationsmethode funktionalisiert, konnte eine Sättigung mit Liganden bei etwa 600 µg/mL ermittelt werden. Mittels Einmischmethode funktionalisierte Hydrogele erreichten keine maximale Ligandenkonzentration in den Schichten, mit dem Verhältnis 2/1 als maximales verwendetes Verhältnis. Höhere Liganden zu Prepolymer Verhältnisse als 2/1 wurden jedoch nicht verwendet, um eine ausreichende Vernetzung der Hydrogele nicht zu gefährden. Zur Detektion mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Flugzeit-Sekundärionen-Massen-spektrometrie (TOF-SIMS) (Kapitel 4) wurden eine fluorierte Aminosäure und ein iodiertes Peptid mit den Prepolymeren in molaren Verhältnissen von 1/2, 1/1 und 2/1 gemischt. Beide Methoden ermittelten eine maximale Ligandenkonzentration bei Verhältnissen von 1/1. Zusätzliche Liganden (2/1) führten zu keiner vermehrten Anbindung. Wesentlich im Zusammenhang mit der Ligandenquantifizierung auf Biomaterialien ist, diese an der Oberfläche, die für Zellen zugänglich ist, durchzuführen. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Oberflächensensitive Quantifizierung) kamen daher Methoden zum Einsatz, die Liganden ausschließlich auf der Oberfläche quantifizierten. Zur Detektion mit Oberflächenplasmon-resonanz (SPR) und akustischer Oberflächenwellentechnologie (SAW) in Kapitel 5 musste die Standardbeschichtung der Hydrogele von Glas und Silikon auf Cystamin funktionalisierte Goldoberflächen übertragen werden. Mittels Ellipsometrie und Rasterkraftmikroskopie (AFM) konnte nur eine dünne und inhomogene Hydrogelbeschichtung nachgewiesen werden. Dennoch zeigten SPR und SAW die Unterbindung von Serum und Streptavidin (SA) Adsorption auf nicht funktionalisierten Schichten, jedoch eine spezifische und konzentrationsabhängige SA Bindung auf Hydrogelschichten, die mit Biocytin und GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden. Die Ligandenquantifizierung mittels Enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) und Enzymgekoppelten Lektinadsorptionstest (ELLA) (Kapitel 6) wurde auf Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas angewendet, die mit verschiedenen Liganden mittels Inkubation und Einmischung funktionalisiert wurden. Das Modellmolekül Biocytin, das biotinylierte Peptid GRGDSK-biotin, das ECM Protein Fibronektin (FN), als auch die Modellzucker N-Acetyl-glukosamin (GlcNAc) und N-Acetyllaktosamin (LacNAc) konnten spezifisch in verschiedenen Konzentrationen nachgewiesen werden. Beispielhaft seien hier Schichten auf Glas genannt, die mittels Einmischmethode mit GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden, da diese zum Vergleich in Kapitel 8 herangezogen wurden. Auf diesen Oberflächen wurde eine maximale Peptidkonzentration auf der Oberfläche bei einem Peptid zu Prepolymer Verhältnis von 1/5 ermittelt. Neben diesen verschiedenen Quantifzierungsmethoden ist die in vitro Analyse mit Zellen nicht zu vernachlässigen (Kapitel 7). Hierzu wurden Hydrogele auf Glas aufgebracht und mit GRGDS mittels Einmischmethode funktionalisiert. Durch Zählen adhärenter primärer humaner dermaler Fibroblasten (HDF) auf Mikroskopbildern wurde eine maximale Zelladhäsion bei dem Peptid zu Prepolymer Verhältnis von 1/5 festgestellt. Hingegen wurde ein Verhältnis von 1/2 für optimale Zelladhäsion ermittelt, wenn Zellen zur Quantifizierung von den Hydrogelen abgelöst und im CASY® Zellzähler quantifiziert wurden. Zusätzlich wurde die Zellvitalität durch Messung intrazellulärer Enzymaktivitäten gemessen, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen Zellvitalität und GRGDS Konzentration hergestellt werden. Adhärente HDFs waren in allen Fällen vital, unabhängig von der Ligandenkonzentration auf der Oberfläche. Auch die Mausfibroblasten Zelllinie NIH L929 wurde auf Hydrogelen mit verschiedenen GRGDS zu Prepolymer Verhältnissen durch Zählen adhärenter Zellen auf Mikroskopbildern untersucht. Diese im Verhältnis zu HDFs wesentlich kleineren Mauszellen benötigten höhere GRGDS Konzentrationen (2/1) für maximale Zelladhäsion. Nach der Ligandenquantifizierung in Kapitel 3 bis 7, wurden diese Ergebnisse in Kapitel 8 miteinander verglichen. Hierzu wurden Messungen auf Hydrogelschichten verwendet, die mittels Einmischmethode funktionalisiert wurden. Während die Quantifizierung mittels Radioaktivmessung in der gesamten Tiefe der Hydrogelschichten keine maximale Ligandenkonzentration ermitteln konnte, war in den oberen Bereichen der Schicht ein Maximum an Liganden bei 1/1 festzustellen (XPS, TOF-SIMS). SPR und SAW wurden zum Vergleich nicht herangezogen, da die Beschichtung auf Gold erst optimiert werden muss. Oberflächensensitive Quantifizierung mittels ELISA und Zelladhäsion, die lediglich die sterisch zugänglichen Liganden auf einer Oberfläche nachweisen, ergaben übereinstimmend eine optimale Ligandenkonzentration für SA Bindung und Zelladhäsion bei einem Peptid zu Prepolymer Verhältnis von 1/5. Dies unterstreicht, wie wichtig der Vergleich der Methoden, als auch die Verwendung von oberflächensensitiven Methoden ist. Der dritten Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen und strukturellen Nachahmung der komplexen extrazellulären Umgebung (Advanced ECM engineering), ein wichtiger Aspekt in der Biomaterialforschung, da zum größten Teil zwei-dimensionale Biomaterialien zum Einsatz kommen, die direkt mit Liganden kovalent funktionalisiert werden. Die ECM ist jedoch um ein Vielfaches komplexer und die bestmögliche Nachahmung ist Voraussetzung für eine bessere Akzeptanz durch Zellen und Gewebe. In Kapitel 9 wurde eine Möglichkeit aufgezeigt, das ECM Protein FN nicht-kovalent über Zucker-Lektinbindungen zu immobilisieren. Ein Schichtaufbau von Hydrogel, dem darauf durch Mikrokontakt-druckverfahren (MCP) kovalent gebundenen Zucker Poly-N-Acetyllaktosamin (polyLacNAc) und den darauf nicht-kovalent gebundenen Galektin His6CGL2 und FN, konnte mit Fluoreszenzfärbung elegant nachgewiesen werden. Optimale Konzentrationen für den Schichtaufbau wurden mittels ELLA/ELISA auf Hydrogelschichten ermittelt, die durch Inkubation mit dem Zucker funktionalisiert wurden. Nur der komplette Schichtaufbau konnte zufriedenstellende HDF Adhäsion vermitteln und im Vergleich zu Zellkulturpolystyrol (TCPS) Oberflächen konnten HDFs auf dem biomimetischen Schichtaufbau schneller adhärieren und spreiten. Zudem wurde die Umorganisierung von auf Glas adsorbiertem FN, auf NCO-sP(EO-stat-PO) kovalent gebundenem FN und biomimetisch über polyLAcNAc-His6CGL2 gebundenem FN durch HDFs verglichen. Nur auf den biomimetischen Oberflächen schien eine Umorganisation durch die Zellen möglich, wie sie auch in der ECM zu finden ist. Diese biomimetische und flexible Präsentation eines Proteins erwies sich als vielversprechende Möglichkeit eine biomimetischere Oberfläche für Zellen zu schaffen, die eine optimale Biokompatibilität ermöglichen könnte. Auch die strukturelle Nachahmung der ECM ist eine vielversprechende Strategie zum Nachbau der ECM. In Kapitel 10 wurde ein Einschrittverfahren zur Herstellung synthetischer, bioaktiver und degradierbarer Faserkonstrukte durch Elektrospinnen zur Nachahmung der ECM präsentiert. In diesem System wurden durch Zugabe von NCO-sP(EO-stat-PO) als reaktives Additiv zu Poly(D,L-laktid-co-Glycolid) (PLGA) Fasern hergestellt, die mit einer ultradünnen, inerten Hydrogelschicht versehen waren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Verwendung von NCO-sP(EO-stat-PO) als Additiv die Adsorption von Rinderserumalbumin (BSA) im Vergleich zu PLGA um 99,2% reduziert, die Adhäsion von HDFs verhindert und die Adhäsion von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) minimiert werden konnten. Spezifische Bioaktivierung wurde durch Zugabe von Peptidsequenzen zur Spinlösung erreicht, welche kovalent in die Hydrogelschicht eingebunden werden konnten und kontrollierte Zell-Faser Interaktionen ermöglichten, Um die spezifische Zelladhäsion an solchen inerten Fasern zu erzielen, wurde GRGDS kovalent auf der Faseroberfläche gebu
Author: Meike V. Beer
Language: English
Subfield: Surfaces, Coatings and Films
Field: Materials Science
Domain: Physical Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W3155822430