Year: 2021
Type: article
Abstract: Three-dimensional cell cultures (“organoids”) promise to better recapitulate native tissue physiology than traditional 2D cultures and are becoming increasingly interesting for disease modeling and compound screening efforts. While a number of protocols for the generation of neural organoids have been published, most protocols require extensive manual handling and result in heterogeneous aggregates with high sample-to-sample variation, which can hinder screening-based strategies. We have now developed a fast and efficient protocol for the generation and maintenance of highly homogeneous and reproducible midbrain organoids. The protocol is streamlined for use in fully automated workflows but can also be performed manually without the need for highly specialized equipment. It relies on the aggregation of small molecule neural precursor cells (smNPCs) in standard 96-well V-bottomed plates under static culture conditions without cumbersome matrix embedding. The result is ready-to-assay uniform 3D human midbrain organoids available in freely scalable quantities for downstream analyses in 3D cell cultureGraphic abstract:Automated midbrain organoid generation workflow and timeline, [摘要]三-三维细胞培养物（“类器官”）承诺更好综述自然组织的生理比传统的2D培养和正在成为疾病建模越来越有趣和化合物筛选工作。尽管已经发布了许多用于生成神经器官的协议，但是大多数协议都需要大量的人工处理，并且会导致样本间差异很大的异类聚集体，这可能会阻碍基于筛选的策略。我们现在已经开发了一种快速高效的协议，用于生成和维护高度 均质且可重现的中脑类器官。该协议已简化为可在全自动工作流程中使用，但也可以手动执行，而无需高度专业化的设备。它依赖于小分子神经前体细胞（的聚集smNPCs在标准的96孔V形底）ED下板的静态培养条件而无需麻烦的基质嵌入。结果是现成可测定的统一3D人类中脑类器官，可以自由扩展的量用于3D细胞培养的下游分析。图形摘要： 自动化的中脑类器官生成工作流程和时间表 [背景]尽管包括二维细胞培养和动物模型的经典临床前模型系统已经推动我们的人类生物学和疾病的认识，越来越多的避开了这些标准模型系统人类特有的过程的证据。特别地，人脑在其结构和生理学方面是独特的，并且已经证明在研究环境中难以近似（Kim等人，2020）。类器官，即，干细胞衍生的，自组织的，三维微组织，可能人体器官的结构和功能比以前的模型系统更好的模拟方面（佐藤等人。，2009;斯特等人。，2013; Takasato等人。，2015;麦克拉肯。等人，2014;染料等。，2015） ，从而PROMIS荷兰国际集团改进我们人类独有的过程的理解（Fatehullah和Barker 2016;杜塔。等人，2017） 。 在最近几年，不同的群体都集中在模仿特定的大脑区域，以便更好地理解发展和疾病过程中的组织生物学。特别感兴趣的一个区域是中脑，因为它早期参与了帕金森氏病，帕金森氏病是第二大最常见的神经退行性疾病，影响2-3％的65岁或65岁以上的人（Poewe等人，2017）。尽管已经开发出许多不同的中脑类器官系统（Jo等人，2016; Qian等人，2016; Monzel等人，2017），但疾病建模需要高度的同质性，可再现性和规模化事实证明，药物开发具有挑战性。 我们最近发布了自动中脑类器官（AMO）的生成，它们是专门为克服这些挑战而开发的（Renner et al 。，2020）。AMOS是高度可重现的和均匀的，关于其大小，形态，基因和蛋白质表达，功能性（即，神经活动），并响应于化合物。它们是由小分子神经前体细胞（smNPC ）产生的，该细胞类型经过优化，可轻松实现基于小分子的处理以及快速而强大的神经分化（Reinhardt等人，2013）。结合无需任何人工干预（例如，基质嵌入）的类器官生成工作流程，这使得我们的协议易于再现，并产生高度均一的中脑类器官。因此，AMO非常适合所有需要大量具有明确定义和可预测参数的可比样品的应用，尤其是化合物筛选。但是，许多其他应用（包括疾病建模和发育生物学）也可以从均质的起始条件中大大受益，而无需行业规模的样本数量。像AMO一样的可预测3D模型有助于区分正常的生物学差异和遗传疾病模型中例如单点突变的影响。因此，我们开发的协议，也可以用手动移液和标准实验室设备完全兼容，使其可以和有用到大量的观众。 虽然一般的工作流程在此描述中可以应用到许多不同的器官样的协议和起始的细胞类型，我们注意到，smNPCs不能形成前脑组织体。smNPC仅限于中脑和后脑的命运，包括运动神经元的产生。有关详细信息，请参见（Reinhardt等，2013）。而且，smNPC不会形成神经花环。我们对中脑类器官进行了优化，以提高同质性，从而以复杂性为代价促进筛选策略。如果需要强大的内部组织极性，我们建议从其他受限制较少的细胞类型开始培养，包括比smNPC甚至PSC发育阶段更早的多能干细胞（PSC）衍生NPC，否则可能会增加类器官异质性的风险。 。
Source: BIO-PROTOCOL
Institution: Max Planck Institute for Molecular Biomedicine
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: hybrid
Awards: G1721863585, G434337789
OpenAlex ID: W3172441770