Genetic analysis of familial Alzheimer’s disease, primary lateral sclerosis and paroxysmal kinesigenic dyskinesia: a tool to uncover common mechanistic points
Year: 2021
Type: dissertation
Study design: Observational Study
Abstract: Las enfermedades neurológicas pueden tener un amplio espectro de fenotipos, causando interrupciones en las actividades de la vida diaria y, a menudo, una enfermedad progresiva que termina en la pérdida de la vida. Los mecanismos moleculares que subyacen a muchas de estas enfermedades pueden tener vías comunes y, dependiendo del gen en cuestión, su disfunción puede llevar a una variedad de condiciones. La enfermedad de Alzheimer (EA) es la demencia neurodegenerativa más común en el mundo, con una estimación de 50 millones de personas que viven con demencia en todo el mundo. Los síntomas de la EA incluyen dificultad para recordar nombres o eventos recientes, apatía, depresión , desorientación, confusión, dificultad de hablar, caminar y tragar. La división canónica de la EA en inicio temprano (EOAD por sus siglas en inglés) e inicio tardío (LOAD por sus siglas en inglés) se establece en los 65 años de edad. Ambos se caracterizan por agregados de proteína tau hiperfosforilada intracelular llamados ovillos neurofibrilares (NFT por sus siglas en inglés) y placas seniles extracelulares compuestas principalmente por grupos de péptido amiloide-β (Aβ). La patología de EA comienza en la corteza entorrinal, una región del lóbulo temporal medial, y causa la muerte de las neuronas provocando la atrofia del tejido cerebral. La EA es una enfermedad multifactorial con un patrón de herencia dicotómico. Aproximadamente el 70 % de las causas son genéticas y el resto ambientales. Mutaciones en los genes: APP, PSEN1 y PSEN2, son las causas más comunes de EOAD y el alelo ε4 de APOE es un factor de riesgo bien establecido de LOAD. Tres vías principales contienen la mayoría de los factores de riesgo genéticos de EA: la respuesta inmune, el metabolismo lipídico y la endocitosis. Entre los genes involucrados en la respuesta inmune, CR1 se ha asociado con la EA mediante estudios de asociación de todo el genoma (GWAS por sus siglas en inglés). CR1 forma un parte importante del sistema del complemento y es significativo para este trabajo. Una isoforma de CR1, CR1*2, se expresa en niveles más bajos que la isoforma CR1*1 y se especula que provoca un menor aclaramiento de Aβ y una desregulación del sistema del complemento. La esclerosis lateral primaria (ELP) se considera una parte del espectro patológico de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La ELA, aunque se considera una enfermedad rara, es la enfermedad de la neurona motora (ENM) más común. La ELP se caracteriza por la espasticidad espinobulbar causada por la degeneración de las neuronas motoras superiores (NMS), mientras que la ELA se caracteriza por la degeneración tanto de las NMS como de las neuronas motoras inferiores (NMI) a nivel espinal y bulbar, lo que causa parálisis de las extremidades, disartria, disfagia y muerte por insuficiencia respiratoria. Características clínicas de ELP incluyen la espasticidad, ligera debilidad en las extremidades inferiores, inicio en adultos, curso progresivo, duración de más de 4 años y los síntomas seudobulbares. Los déficits cognitivos y conductuales pueden ocurrir con ELA, que van desde la demencia leve, moderada a la demencia frontotemporal (DFT) que también se observó en pacientes con ELP. La base genética de la ELP no se conoce bien, aunque se conocen mutaciones en los genes SPG7 y TBK1 en pacientes afectados por ELP familiar. Las mutaciones en el gen SOD1, que codifica una enzima antioxidante, y en la proteína codificada por el gen C9orf72 son las causas más comunes de ELA. La patogenia de la ELA puede ser causada por excitotoxicidad del glutamato, disfunción mitocondrial, alteración de la estructura o transporte en los axones y estrés oxidativo. La discinesia paroxística cinesigética (PKD por sus siglas en inglés), el trastorno del movimiento paroxístico más común, se caracteriza por una variedad de movimientos involuntarios desencadenados por movimientos repentinos. Con inicio en la niñez o adolescencia, sus características clínicas incluyen ataques recurrentes que involucran corea, atetosis, posturas distónicas o balismo. La gravedad de estos ataques suele disminuir con la edad. Las mutaciones en el gen PRRT2 son, hasta ahora, la única causa conocida de este trastorno. Se sabe que PRRT2 interactúa con las proteínas SNAP-25, SYT1 y SYT2 en la membrana presináptica de las neuronas, que participan en la señalización en las células nerviosas. La falta de PRRT2, a menudo causada por la vía de degradación del ARN mensajero mediada por mutaciones terminadoras (NMD por sus siglas en inglés), debido a codones de terminación prematura (PTC por sus siglas en inglés) en el transcripto, es el mecanismo molecular común involucrado en la haploinsuficiencia que causa PKD. Objetivos El objetivo principal de este trabajo es comprender la etiopatogenia de tres enfermedades neurológicas que afectan a tres familias españolas distintas y estudiar los mecanismos genéticos y moleculares que afectan a estas enfermedades. Materiales y métodos Se recogieron muestras de ADN de miembros de tres familias españolas: UGM037 (11 individuos) afectados por EA, UGM471 (7 individuos) afectados por ELP y UGM478 (7 individuos) afectados por PKD. También se dispone de una población de control de individuos sanos y otra de individuos afectados por EA disponible. Las muestras se recogieron con la aprobación de los Comités de Ética en la Investigación de los hospitales correspondientes con el consentimiento informado firmado por los pacientes. La cepa bacteriana utilizada para todas las manipulaciones necesarias fue Escherichia coli DH5α y la línea celular humana fue SH-SY5Y. La secuenciación del exoma completo (WES por sus siglas en inglés) se utilizó como herramienta para identificar variantes dentro del exoma de los pacientes. A través de “base-calling” y análisis de imágenes, alineación de lectura y “SNP calling”, los datos podrían transformarse en una base de datos viable de variantes. Se utilizó el filtrado y la priorización seguida de la validación de secuenciación de Sanger de los resultados para identificar las variantes más interesantes, posiblemente involucradas en la causa de las enfermedades. Para la evaluación de variantes se utilizaron bases de datos públicas como Collaborative Spanish Variant Server (CSVS) o Genome Aggregation Database (gnomAD). La frecuencia de la variante también se verificó mediante PCR específica de alelo (ASPCR por sus siglas en inglés) realizada en las poblaciones de control. Después de identificar las variantes más interesantes, se realizaron manipulaciones de plásmidos para obtener ADNc, correspondientes a secuencias de los genes con estas variantes, en vectores de expresión específicos. Se utilizó mutagénesis dirigida para la introducción de variantes de un solo nucleótido (SNV por sus siglas en inglés), el epítopo FLAG y sitios de restricción enzimática. La subclonación se utilizó para transferir ADNc específicos a los correspondientes vectores de expresión. El análisis in silico se realizó utilizando los servicios web HOPE, I-Mutant 2.0 y ConSurf. De esa forma se pudo establecer la influencia de una variante específica en la función y estabilidad de la proteína. También el grado de conservación de los residuos. En el caso de genes implicados en la EA, conocer los genotipos de APOE y CR1 es importante y se realizó mediante PCR. En el caso de APOE, la PCR fue seguida por restricción enzimática y análisis del patrón de bandas en un gel de agarosa. En el caso de CR1, la PCR fue seguida por secuenciación de Sanger o análisis de presencia o ausencia de bandas en un gel de agarosa. Las células SH-SY5Y se mantuvieron en un medio de crecimiento completo y se utilizó el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 para transfectarlas con plásmidos correspondientes a experimentos específicos. Un experimento consistió en comparar los niveles de ARNm y proteínas de genes específicos afectados por las variantes identificadas. En otro, se realizó la misma comparación después de la inhibición de la vía NMD, usando NMDI14. Para medir los niveles de ARNm, se extrajo el ARNm de células SH-SY5Y transfectadas después de aproximadamente 48h de incubación y se obtuvo el ADNc mediante retrotranscripción. Estos se utilizaron en PCR cuantitativa (qPCR por sus siglas en inglés) con cebadores diseñados específicamente para amplificar el producto de la transcripción reversa con controles apropiados. Para medir los niveles de proteína, las proteínas se extrajeron de las células SH-SY5Y transfectadas después de aproximadamente 48h de incubación y se usaron para el análisis por Western Blot (WB). El gen constitutivo de actina se utilizó como control. Para el análisis funcional de las distintas variantes de ADPRH, las proteínas se extrajeron de las células SH-SY5Y transfectadas y se sometieron a purificación utilizando una columna de afinidad de proteínas marcadas con GST. Después de la diálisis y concentración de la muestra, las proteínas podrían usarse para un ensayo de actividad. Esto implicó la ADP-ribosilación del sustrato por la toxina del cólera (CT) seguida de la hidrólisis de este enlace por ADPRH y sus variantes. Las muestras se cargaron luego en una columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC por sus siglas en inglés) que permitió la separación, identificación y cuantificación de los componentes basándose en los datos de un detector que mide la absorbancia a 260 nm. También se utilizó co-inmunoprecipitación con extractos de proteínas de células SH-SY5Y cotransfectadas con ADPRH y ADPRHL1 para determinar si tiene lugar la interacción proteína-proteína. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student y ANOVA unidireccional o bidireccional para comparar las diferencias entre las medias de los grupos, con una prueba post hoc de Tukey de comparaciones múltiples de medias. Se utilizó el software R para realizar las pruebas. Resultados y discusión La filtración, priorización y validación mediante secuenciación Sanger ident
Author: Jacek Pawel Szymanski
Language: English
Subfield: Cellular and Molecular Neuroscience
Field: Neuroscience
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W3192648521