Year: 2023
Type: article
Abstract: 为抵抗病毒的频繁入侵，原核生物进化出了许多精巧的防御策略，被统称为“原核免疫系统”[1-3]。原核生物与病毒之间的生存竞争是自然界最大规模的战争，也是生物技术的宝库。其中，限制-修饰系统[4]和CRISPR-Cas系统[5]是分布最为广泛的原核免疫系统，它们的机制解析分别带来了基因工程和基因编辑的技术革命，均被授予诺贝尔奖。最近爆发的微生物宏基因组分析表明自然界中存在大量潜在的未发掘原核免疫系统[6-11]，远远超出目前的认知。2018年，Doron等在Science上报道了十种新发现的原核免疫系统[7]，以立陶宛神话中的守护女神命名的Gabija细菌防御系统就是其中之一，它存在于~15%已测序微生物基因组中[7,12,13]，在自然界丰度仅次于限制-修饰系统和CRISPR-Cas系统，仅包含GajA和GajB两个未知功能蛋白质(图1(a))，其具体作用机制尚不清楚。 本课题组基于长期的核酸代谢酶研究基础首次对Gabija系统的分子机制开展研究。此前，我们在Nucleic Acids Research上报道了GajA是一个受NTP浓度负调控的DNA切刻内切酶，病毒侵入后高强度的转录降低了细菌细胞内NTP浓度，使GajA活性得以激活，对病毒和细菌自身DNA进行切割[14]。然而，仅有GajA还不足以完成抗病毒免疫，GajB也是Gabija防御的必需元件。在此基础上，我们进一步对GajB的功能及Gabija系统的作用机制开展了深入研究，相关工作发表于Cell Host & Microbe[15]。 为探索Gabija系统的防御机制，我们将来源于Bacillus cereus VD045的Gabija系统(图1(a))转入大肠杆菌，可以高效抵抗各类烈性病毒的侵染。基于GajA能同时有效切割病毒和细菌自身基因组DNA的结果[14]，我们推测Gabija系统可能是一个流产感染系统。进一步研究发现：在低MOI侵染条件下，含Gabija系统的细菌表现出明显的噬菌体抗性；在高MOI侵染条件下，含Gabija系统的细菌裂解更快，但继续培养几个小时后能够恢复生长(图1(b))，而且裂解的细菌中子代噬菌体的释放也显著降低，符合流产感染的典型特征。以上结果表明Gabija系统通过一种流产感染的机制执行抗病毒功能。虽然Gabija系统能有效抵抗各类烈性病毒，但即使对非天然宿主也完全无细胞毒性，使Gabija系统成为自然界最广谱高效且精简的免疫系统之一。 虽然前期研究已明确GajB是Gabija系统的必需组分[14]，但GajB的具体功能仍然未知。生物信息学分析预测GajB是一个UvrD-like解旋酶[7]，然而，我们研究发现GajB是一个受DNA末端激活的A/GTP水解酶(图1(c))，并未检测到预测的解旋酶活性，其激活信号是具有一定长度DNA的3’末端。有趣的是，我们还发现来源于B. cereus VD045的Gabija系统中存在两种形式的GajB，这是此前生物信息学分析没有预测到的，二者仅在N端相差五个氨基酸，它们在功能上是冗余的，全长GajB具有更强的体外活性和体内抗病毒功能。GajB的这种表达模式在不同微生物中具有一定保守性，我们分析发现大约21.1% (970/4598)的Gabija系统可能表达两个共线的GajB，推测GajB这种表达模式在某些特定条件下可能具有调控作用或者有利于抗病毒功能的发挥。此外，我们之前的研究发现，GajA活性受NTP浓度负调控[14]，但其抑制机制并不清楚，本研究发现ATP有效抑制GajA与DNA的结合，表明ATP通过抑制GajA与DNA的特异结合从而抑制它的DNA切割活性。 GajA和GajB在体内和体外都能结合形成复合体，且对Gabija系统的防御功能都是必需的，暗示它们具有相互作用，共同协调执行抗病毒功能，进一步研究印证了这一猜测。体外活性分析实验发现适量的GajB可以促进GajA的切割活性，同时GajA也能有效促进GajB的ATP水解活性(图1(d))。另外，在T7噬菌体入侵条件下，含Gabija系统的细菌中噬菌体DNA的积累显著下降，荧光显微镜检测进一步证实了Gabija系统在防御过程中会造成宿主DNA降解，这与流产感染的机制是一致的。同时，在T7噬菌体入侵后，含Gabija系统的细菌中A/GTP含量显著下降。 总的来说，本项工作通过详尽的遗传学和生物化学研究，揭示了GajB的功能和Gabija系统抗病毒的核心机制。GajA切割DNA活性受核苷酸调控，GajB感知DNA末端水解核苷酸，它们的激活信号和反应效果恰好互补，这两个酶分别感知病毒的转录和DNA复制起始反应，并通过反应效果与激活信号的互补互相激活产生级联放大的正反馈循环，破坏细胞DNA同时消耗重要代谢物A/GTP，导致细胞死亡和流产感染(图1(e))。GajA和GajB形成复合物以增强协同效果，但复合物中GajB的量必须低于GajA才能执行免疫功能，GajA和GajB的剂量比例通过一种转录终止机制进行调控，过量的GajB会导致形成巨大复合物影响GajA结合DNA(图1(e))。GajA和GajB都同时作为信号感应器和效应子执行抗病毒功能，两种前所未见酶活性的巧妙配合使Gabija免疫机制显著区别于已知免疫机制。限制-修饰系统和CRISPR-Cas系统机制解析早期工作由欧美众多实验室完成，而Gabija免疫核心机制由本课题组通过生化手段首次阐明。
DOI: 10.1360/tb-2023-0808
Authors: Rui Cheng, Bin Zhu
Institution: Huazhong University of Science and Technology
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: bronze
OpenAlex ID: W4386200940