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Work

Development of a h2-driven enzymatic cascade to produce n-heterocycles in c. necator

Year: 2025
Type: dissertation
Abstract: L'augmentation des émissions de CO2 nécessite des alternatives pour réutiliser cette source de carbone abondante mais sous-exploitée. Une approche prometteuse et utiliser le CO2 comme source de carbone pour soutenir les organismes autotrophes, et réaliser la biosynthèse des produits d'intérêt. Les microorganismes autotrophes assimilent naturellement le CO2 et utilisent la lumière ou des composés inorganiques comme sources d'énergie. Cependant, ces nécessitent encore du génie génétique pour répondre aux exigences de productivité et d'efficacité industrielles. Parmi eux, Cupriavidus necator est une bactérie chimiolithotrophe facultative qui utilise le CO2 comme seule source de carbone, l'H2 comme source d'énergie et l'O2 comme accepteur d'électrons. Son métabolisme a permit la production de diverses molécules d'intérêt commercial, mais peu d'études ont été fait sur l'utilisation du H2 pour obtenir des produits chimiques fins.Dans cette étude, un nouveau procédé a été exploré pour obtenir des molécules à haute valeur ajoutée chez C. necator à l'aide d'une cascade d'enzymes alimentée en H2. La production d'hétérocycles azotés (N-hétérocycles) a cause de son importance dans la production de produits pharmaceutiques. La thèse utilise trois oxydoréductases différentes pour établir une cascade enzymatique fonctionnelle in vivo chez C. necator. La cascade se compose de variants hétérologues de la putrescine oxydase (PuOx) dépendante de l'O2, de l'imine réductase (IRED) dépendante du NADH et de l'hydrogénase soluble dépendant à le NAD+ (SH) qui est native de C. necator et est utilisée pour le recyclage des cofacteurs.C. necator a été génétiquement modifié pour produire les variants hétérologues de PuOx et IRED. La production protéique a été testée en conditions hétérotrophes sur milieu minimal, avec plusieurs souches évaluées pour améliorer l’expression. Des essais enzymatiques ont confirmé l’activité de l’IRED dans l’extrait soluble. La production de PuOx et d’IRED a également été observée sous conditions hétérotrophes et lithoautotrophes.En parallèle, la transition de l’hétérotrophie à la lithoautotrophie a été optimisée en comparant des précultures sur fructose ou glycérol. Une stratégie en trois étapes, utilisant du glycérol en dernière préculture, a permis de réduire significativement la phase de latence des cultures lithoautotrophes. Ce protocole a également servi à évaluer l’effet de la putrescine, substrat potentiel de la cascade. Les analyses de croissance et de cytométrie ont montré que C. necator tolère jusqu’à 100 mM de putrescine sans impact majeur sur le taux de croissance spécifique, bien qu’une phase de latence prolongée et une modification de la morphologie cellulaire aient été observées.C. necator a été modifié pour la co-expression de PuOx et IRED. Les premières expériences avec la cascade enzymatique ont révélé des difficultés dans l'étape catalysée par PuOx. Des analyses ont confirmé que la réaction catalysée par l'IRED avait une conversion de 0,8 % après 48 h de biotransformation en lithoautotrophie. L'expression de l'IRED a été optimisé, et les performances de biotransformation ont été comparé entre conditions hétérotrophes et lithoautotrophes. Après optimisation, une conversion de 67 % a été obtenu en 24 h en lithoautotrophie avec un mélange de gaz non explosif, plus rapide que dans des conditions hétérotrophes.Cette étude a établi les bases d'une stratégie de biotransformation robuste chez C. necator, démontrant son potentiel en tant qu'hôte microbien durable pour la production de N-hétérocycles. Les travaux futurs se concentreront sur l'optimisation de la productivité, l'amélioration de l'expression de PuOx et le traitement en aval. En intégrant des oxydoréductases dans le métabolisme à base d'H2 de C. necator, cette recherche met en évidence le potentiel des biotransformations lithoautotrophes et positionne C. necator comme un microorganisme clé dans la transition vers une bioéconomie basée sur le CO2.
Author: Castro González, Itzel
Language: English
Open Access status: green
OpenAlex ID: W4416119219
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