A novel lentivirus system to decode the non-coding DNA associated with Type-2 Diabetes risk
Year: 2023
Type: dissertation
Abstract: Diabetes tipo 2 (T2D) é considerado uma pandemia dos tempos modernos e está associado a complicações graves, como doenças cardiovasculares e uma maior probabilidade de mortalidade prematura. A suscetibilidade genética a T2D está ligada a polimorfismos de nucleótido único (SNPs) em regiões de possíveis potenciadores, o que implica que alterações na regulação transcricional desempenham um papel no desenvolvimento da doença. Neste trabalho, o nosso objetivo é: 1) desenvolver um ensaio repórter de potenciadores adequado para testes em larga escala, 2) validar possíveis potenciadores de células beta humanas potencialmente associados ao desenvolvimento de T2D e 3) decifrar funcionalmente o código nucleotídico dos potenciadores validados. Construímos um lentivírus compatível com a clonagem em larga escala de bibliotecas de potenciadores, contendo um promotor mínimo e EGFP como gene repórter, para avaliar a atividade dos potenciadores clonados. Utilizando um potenciador do pâncreas endócrino previamente validado, testámos vários promotores mínimos e diferentes arquiteturas do lentivírus. Clonámos este potenciador a montante do promotor mínimo, a abordagem mais simplificada para testar a atividade do potenciador, ou a jusante, uma configuração que potencialmente recapitula a interação endógena potenciador-promotor através do looping da cromatina. Isto permitiu-nos encontrar a melhor solução que gera a maior relação sinal-ruído, mantendo simultaneamente as condições endógenas relativas à funcionalidade do potenciador. Em seguida, utilizámos marcas bioquímicas associadas à atividade de potenciador e SNPs associados a T2D para definir uma lista de aproximadamente 300 sequências reguladoras candidatas (CRSs). Clonámos esta biblioteca de CRSs no lentivírus desenvolvido, infetámos células MIN6 e através de FACS-sorting, isolámos células portadoras de CRSs capazes de aumentar a expressão de GFP para análise por sequenciação de nova geração (NGS) e para estabelecer linhas repórteres contendo um único potenciador. Os resultados deste estudo são cruciais para descodificar os mecanismos subjacentes às sequências de nucleótidos dos potenciadores e o seu impacto na expressão genética e, em última análise, no desenvolvimento do T2D.
Author: Nogueira, João Miguel Carvalho
Language: Portuguese
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W7011894918