Karakterizacija znotrajceličnega prometa in signaliziranja s herpesvirusnimi s proteinom G sklopljenimi receptorji
Year: 2023
Type: dissertation
Abstract: Cilj disertacije sta opredelitev in primerjava molekularnih in bioloških lastnosti ortologov BILF1, kodiranih v treh prašičjih limfotropnih herpesvirusih (PLHV1-3) in humanem virusu Epstein-Barr (EBV). Proučevali smo lokalizacijo, konstitutivno internalizacijo, konstitutivno aktivnost in imunoregulatorno vlogo receptorjev PLHV1-3 BILF1 in te lastnosti primerjali z receptorjem EBV-BILF1. V raziskavi smo prvič opisali lastnosti endocitoze za vse štiri naštete receptorje BILF1. Z encimsko-imunskim testom (ELISA) in fluorescenčno mikroskopijo smo potrdili ohranjeno lokalizacijo na celični površini. Konstitutivno internalizacijo smo dokazali s pristopom, ki obravnava od temperature odvisno endocitozo receptorjev v različnih časovnih intervalih (iz angl. antibody-feeding), in z novim testom internalizacije v realnem času. Z dominantno negativno mutanto (DNM) in kemičnim zaviralcem smo pokazali vključenost klatrinske poti pri internalizaciji receptorjev BILF1. Z analizo bioluminiscenčnega prenosa (BRET2) in bioinformacijskim pristopom smo potrdili, da mehanizem ni odvisen od arestina ß. Dodatno smo potrdili tudi vključenost kaveolina pri internalizaciji receptorjev BILF1. Z luciferaznim testom smo dokazali ohranjenost konstitutivnega znotrajceličnega prenosa signala, odvisnega od G?i, ter različno aktivacijo znotrajceličnih transkripcijskih faktorjev. S prenosom western nismo potrdili aktivacije zunajcelično signalno regulirane kinaze (ERK1/2). Sposobnost receptorjev BILF1 za izmikanje imunskemu sistemu smo potrdili s pretočno citometrijo in metodo fluorescenčne mikroskopije. Pokazali smo, da je sposobnost zniževanja površinske izraženosti molekul poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (MHC-I) ohranjena za vse receptorje BILF1 v humanih embrionalnih ledvičnih celicah (HEK-293), ne pa tudi v prašičjih ledvičnih celicah (PK-15). Z metodo RT-qPCR smo dokazali povečano izraženost receptorjev PLHV1-BILF1 po razvoju post-transplantacijske limfoproliferativne bolezni (PTLD). Pridobljeni rezultati so prvi korak k vzpostavitvi s PLHV1 okuženega prašičjega modela za bolezen PTLD, ki bi v prihodnje omogočal raziskavo patoloških vidikov bolezni, povezanih z EBV, in raziskavo receptorjev BILF1 kot potencialne tarče za zdravljenje humane oblike bolezni PTLD.
Author: Mavri, Maša
Language: Slovenian
Subfield: Cell Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W7057510301