Imagerie à basse température et multifocale polarisée pour la microscopie de localisation de molécules uniques
Year: 2024
Type: dissertation
Abstract: La microscopie de localisation de molécule unique (SMLM), essentielle dans de nombreuses applications en biologie, permet d’imager des fluorophores de manière stochastique, de localiser précisément leurs centres et de créer une image pointilliste de super-résolution (SR). En dépassant la limite de diffraction, la SMLM révèle la structure d’échantillons biologiques avec des résolutions nanométriques. Ces dernières années, des méthodes ont émergé pour extraire des informations multidimensionnelles en SMLM. Cette thèse s’inscrit dans ce cadre, en se concentrant sur le développement de nouvelles approches pour capturer l'évolution spatio-temporelle des structures biologiques en SR et pour déterminer l'orientation moléculaire.La reconstruction d'une image en SMLM prend généralement des dizaines de minutes, nécessitant une fixation chimique irréversible pour empêcher les mouvements cellulaires, empêchant le suivi temporel de structures cellulaires. Le cryo-arrêt réversible, proposé il y a quelques années, bloque le mouvement moléculaire à -45 °C, permettant l’imagerie SMLM à basse température suivie de la reprise de l’activité cellulaire pour des observations ultérieures. Cependant, les applications biologiques de routine restent difficiles. Aucune reconstruction SR de structures cellulaires n’a été démontrée et les effets de la température sur la photophysique des fluorophores sont inexplorés.Cette thèse introduit une nouvelle implémentation, plus simple et optimisée pour les applications biologiques. Elle examine les effets du refroidissement sur la survie des cellules et l'efficacité du blocage des processus biologiques. De plus, elle étudie l’effet des basses températures sur la photophysique des fluorophores et présente des reconstructions SR de structures biologiques dans des cellules en cryo-arrêt.A température ambiante (TA), la flexibilité des liaisons des fluorophores conduit à des fonctions d'étalement de point (PSF) symétriques. A l’inverse, des fluorophores rigidement attachés à TA ou présentant des mouvements contraints à basse température peuvent produire des émissions polarisées et des PSF déformées. Avec des méthodes appropriées, la détermination de l’orientation de ces molécules peut révéler l’organisation moléculaire dans des structures biologiques. Ainsi, la seconde partie de cette thèse est dédiée à la microscopie de localisation et d’orientation molécules uniques (SMOLM). La méthode 4-polar STORM projette la fluorescence sur 4 polarisations, permettant la détermination de l'orientation 2D et du wobbling (flexibilité), mais il reste difficile de récupérer la position 3D des molécules dans la profondeur de champ.Cette thèse développe la microscopie multi-focale polarisée (PolMFM) pour la détermination simultanée de l'orientation et de la localisation 3D de molécules uniques. Une configuration MFM à 3 plans génère une pile focale 3D instantanée, puis une combinaison d’éléments optiques de polarisation permet d’obtenir 4 polarisations et 3 plans focaux simultanément. Malgré la défocalisation des PSFs, nos simulations montrent que l’orientation, le wobbling et la localisation 3D des molécules peuvent être déduites précisément.Le PolMFM est validé en imageant des fluorophores dans un polymère pour éliminer les biais potentiels dans la mesure d'orientation, et dans une bicouche lipidique sur des billes de silice pour démontrer la localisation axiale et l’orientation. Ensuite, la technique est appliquée à l’étude de l'organisation de l'actine dans des cellules fixées et à la réorganisation du génome pendant la spermiogenèse, démontrant sa capacité à obtenir des images SR multidimensionnelles d’échantillons biologiques.Enfin, l'imagerie à basse température est combinée avec le PolMFM pour comparer le wobbling de dipôles fluorescents à différentes températures, révélant une mobilité rotationnelle réduite à basse température et ouvrant de nouvelles perspectives pour la recherche en SMLM et SMOLM à basse température.
Source: theses.fr (ABES)
Author: Régnier, Louise
Language: English
Subfield: Biophysics
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W7066521951
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