Rolle der Tcf1 und Tcf4 Spleißvarianten für die zelltyp-spezifische Expression von Wnt/beta-Catenin-Zielgenen
Year: 2012
Type: dissertation
Abstract: Während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus muss die transkriptionelle Aktivierung von Genen in stadien- und gewebespezifischer Art und Weise erfolgen. Die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen sind jedoch bislang nicht vollständig bekannt. Signalkaskaden wie dem Wnt/beta-Catenin Signalweg und seinen Kerneffektorproteinen, der Familie der Tcf/Lef Transkriptionsfaktoren, wird eine entscheidende Rolle bei diesen Prozessen zugeschrieben. Basierend auf Studien in embryonalen Stamm- (ES-) Zellen ist ein neues Konzept aufgekommen, in dem postuliert wird, dass Gene, die für Entwicklungsregulatoren kodieren, sowie gewebe-spezifische Gene in frühen Embryonalstadien in einem Zustand („poised“) vorliegen, in dem sie zwar transkriptionell abgeschaltet sind, aber rasch induziert werden können. Im Zuge der Differenzierung kommt es entweder zur Aktivierung der Gene in ihren entsprechenden Expressionsdomänen oder zur transkriptionellen Stilllegung. Dieses Modell hebt die regulatorische Funktion der Chromatinstruktur hervor. In Übereinstimmung damit weisen transkriptionell aktive Zielgene des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs Eigenschaften von aktivem Chromatin und Tcf/Lef Besetzung auf während inaktive Gene durch repressives Chromatin und Abwesenheit von Tcf/Lef charakterisiert sind. Allerdings sind bisher weder die kausalen Zusammenhänge zwischen Tcf/Lef Bindung und den Eigenschaften des Chromatins an Wnt-Zielgenen noch die Beziehung zwischen dem Priming-Modell und der Aktivität der Signaltransduktionswege in der Embryonalentwicklung vollständig verstanden. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, sowohl Einblicke in die molekularen Mechanismen der Zelltypspezifität von Wnt-Zielgenen zu bekommen als auch die Rolle der Tcf/Lef Proteine im Hinblick auf Erhalt und Einrichtung von Chromatinkonformationen zu klären, um dadurch ihre Signifikanz für das Priming-Modell zu bestimmen. Dazu wurde ein murines Zellkulturmodellsystem verwendet, das aus E14 ES-Zellen, C17.2 neuralen Vorläufern und C2C12 Myoblasten besteht, und in dem die Wnt/beta-Catenin-Zielgene T/Bra, Cdx1, Cdx2 und Sp5 differenziell reguliert sind. Vergleichende Analysen von repressiven und aktiven Chromatinmodifikationen mittels ChIP sowie Reportergenanalysen und die Tcf/Lef Expressionsprofile legten einen Defekt im Genaktivierungssystem in C17.2 und C2C12 Zellen nahe anstatt einer Verstärkung spezifischer Repressionsmechanismen. Um die Tcf/Lef Familienmitglieder und Spleißvarianten zu bestimmen, die für die Induzierbarkeit von Wnt/beta-Catenin-Zielgenen verantwortlich sind, wurden Reportergenversuche sowie siRNA-vermittelte Tcf/Lef Reduktion und Tcf/Lef Isoform-spezifische Rescue-Experimente durchgeführt. Diese Analysen identifizierten eine besondere Rolle der Tcf1E und Tcf4E Spleißvarianten für die akute transkriptionelle Aktivierung ausgewählter Wnt/beta-Catenin-Zielgene. Tcf1E und Tcf4E heben sich von den anderen Tcf/Lef Isoformen durch das Vorhandensein der C-clamp ab. Von diesem strukturellen Motiv wird angenommen, dass es eine promotor-spezifische Aktivierung durch selektive DNA-Bindung vermittelt. Unerwarteterweise ergaben die ChIP Analysen trotz spezifischer Transaktivierungsfähigkeit ein vermischtes Bindungsmuster der Tcf/Lef Familienmitglieder und sprechen damit gegen das existierende Modell der C-clamp Aktivität. Um zu definieren welche Rolle die potenten Transaktivatoren Tcf1 und Tcf4 in Bezug auf das Priming-Modell spielen, wurden „loss-of-function“ und „gain-of-function“ Analysen durchgeführt. Einerseits wurden in E14 ES-Zellen Effekte des Tcf1/4-Doppelknockdowns auf die Eigenschaften von Chromatin mittels ChIP und FAIRE untersucht und zeigten, dass diese Faktoren für den Erhalt der permissiven Chromatinstruktur entbehrlich waren. Andererseits wurden in C17.2 und C2C12 Zellen die Folgen ektopischer Expression von Tcf1E, dem am stärksten transaktivierenden Faktor, im Hinblick auf Wnt-Induzierbarkeit und Chromatinkonformation getestet. Des Weiteren wurde die Tcf1E-Überexpression mit TSA/Aza Behandlung oder PRC2 Reduktion kombiniert, um repressive Chromatinstrukturen zu schwächen. Tcf1E war jedoch unter keiner der getesteten Bedingungen in der Lage, in repressives Chromatin einzudringen und die Wnt-Induzierbarkeit von reprimierten Genen wiederherzustellen, was auf eine Funktion von nativem Chromatin als grundsätzliche Barriere hindeutet. Insgesamt betrachtet stellten die Ergebnisse eine wichtige Rolle von Tcf1 und Tcf4 für die akute transkriptionelle Aktivierung von Wnt/beta-Catenin-Zielgenen heraus, zeigten aber auch ihre Entbehrlichkeit für den Erhalt und die Generierung permissiver Chromatinstrukturen. Zusammen genommen deutet dies auf eine Hierarchie hin, in der Priming-Faktoren für die Einrichtung offener Chromatinstrukturen benötigt werden, die von Tcf/Lef-Proteinen angesteuert werden können, um die Antwort auf ein Wnt/beta-Catenin-Signal auszulösen.
Author: Wallmen, Britta
Institution: University of Freiburg
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W7172235099