Year: 2012
Type: dissertation
Abstract: Le virus de la grippe est connu de par le monde pour les nombreux problemes de sante publique qu’il cause annuellement (nombreux malades voire meme morts dans les cas les plus invasifs). L’Organisation Mondiale de la Sante (OMS) est perpetuellement en alerte afin d’etre prete a repondre a toute nouvelle epidemie virulente du virus. C’est la raison pour laquelle la vaccination contre le virus influenza est fortement conseillee afin de contrer au mieux l’etendue de l’infection dans la population, incluant principalement les personnes a risque.Les vaccins les plus couramment retrouves sur le marche sont produits a partir d’oeufs embryonnes de poulet et sont composes de virus sous forme inactivee ou encore attenuee. Considerant qu’une dose vaccinale est en moyenne obtenue au depart d’un oeuf, cela pose des contraintes severes au niveau de l’approvisionnement en cas de pandemies durant lesquelles un nombre tres eleve de doses est requis. De plus, les longs delais d’approvisionnement (6 mois environ entre l’isolement de la souche virale et l’obtention du vaccin) ainsi que la possibilite d’un retour a la virulence soulevent certaines problematiques a laquelle la communaute scientifique tente toujours de repondre.
Une des alternatives proposees pour pallier aux lacunes des modes de production traditionnels reside dans l’utilisation de la culture cellulaire comme plateforme de production des virus. Ainsi, plusieurs candidats vaccins contre la grippe, produits dans les cellules CHO ou les cellules VERO, sont actuellement en cours d’essais cliniques. Recemment, une nouvelle generation de vaccins, a base de particules pseudo-virales (ou VLP), a ete developpee. Les principaux avantages de ces particules pseudo-virales resident dans le fait qu’elles sont denuees de genome viral, tout en comportant les antigenes necessaires a l’activation du systeme immunitaire, tels que l’hemagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA).
Cependant, avant de pouvoir transposer la production de vaccins d’influenza a base de VLP dans un contexte industriel, un certain nombre de points critiques restent a developper et optimiser. Notamment, l’absence de genome est l’un des facteurs qui limite toujours l’etablissement d’une methode de quantification efficace pour ces particules. Ceci freine considerablement le developpement des etapes de production et de purification, dont le suivi repose sur des methodes
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analytiques indirectes ou imprecises developpees pour la quantification des proteines totales (SDS-PAGE, Western-Blot, quantification de proteines) ou pour celle de proteines specifiques comme HA (SRID, test HA).
Les objectifs de cette maitrise recherche se sont donc articules autour du procede general des VLP, incluant plus specifiquement l’etude de leur production en culture de cellules d’insectes et la mise au point d’une methode de quantification permettant de soutenir le developpement de cette nouvelle generation de candidats vaccins d’influenza.
La production des VLP a ete analysee avec un systeme d’expression compose de baculovirus recombinants (rBV) exprimant les proteines HA, NA et de matrice M1 dans les cellules d’insectes Sf9 et High Five. Suite a des etapes de purification, les particules generees en cellules Sf9 ont ete analysees par SDS-PAGE, Western-Blot et microscopie electronique. Cette derniere analyse a permis de detecter une contamination importante (100 a 1000 fois superieure a la quantite de VLP presentes) par les baculovirus utilises lors de la production de ces VLP. Une etape de purification supplementaire n’a cependant pas permis de separer efficacement les VLP du reste des contaminants. Malgre plusieurs modifications dans les parametres de production (e.g. choix de cellules hotes, concentration cellulaire a infection, choix de MOI, rapports entre les BV) et dans les parametres de purification (e.g. traitement des cultures), les niveaux d’expression et de purete des VLP n’ont pas pu etre augmentes de maniere significative. Lors de ces essais, il s’est avere que les constructions de baculovirus disponibles, principalement celle contenant HA, etaient instables dans le temps, entrainant des rendements de production tres faibles et limitant par le fait meme la poursuite des travaux d’optimisation de production des VLP.
Parallelement aux tests de production, le developpement d’une methode HPLC en phase inversee a ete entrepris afin de permettre notamment la quantification de HA directement a meme les surnageants de culture. En s’appuyant sur des travaux preliminaires realises sur des doses vaccinales par d’autres groupes de recherche, il a ete possible de mettre en place une procedure adequate permettant de detecter et quantifier de facon rapide et precise la concentration en HA presente dans des echantillons d’une culture de cellules HEK 293 infectees par un virus influenza de la souche A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Par le biais d’essais conduits avec des souches virales distinctes, il a egalement ete demontre que la technique peut etre utilisee pour analyser differents
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types de HA. Dans l’optique d’un criblage rapide et precis des differentes strategies de production des VLP, cette technique se demarque comme etant une methode de choix.----------Every year, influenza is responsible for numerous health problems world-wide mainly due to infections, which can cause death in the most serious cases. The World Health Organization (WHO) is continuously on alert to rapidly respond to the possible emergence of a pandemic viral strain. For this reason, vaccination against influenza is recommended to prevent the infection from spreading to the population, the most concerning cases being within high risk group populations.
Vaccines frequently found on the market are obtained by viral replication in embryonated chicken eggs and contain inactivated or attenuated viruses. However, this production method presents limitations in terms of egg availability in the case of a pandemic as it is estimated that one vaccine dose is produced from one embryonated egg. Moreover, the process is long (about 6 months from the first strain isolation step to the final vaccine formulation) and the risk of virulence reactivation is another drawback that the scientific community is still trying to alleviate.
The use of the cell culture technology as an expressing platform for virus production has been proposed to circumvent the limitations of the current production method. Vaccine candidates against flu that are produced in CHO or VERO cells are currently being evaluated in clinical trials. Recently, a new generation of vaccines, based on Virus Like Particles (VLP) have been developed. These particles present some advantages as their activity relies mainly on influenza’s viral immunogenic activators, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), and are exempt of genetic material of the native virus.
However, some critical points still require further development and optimization to get any influenza VLP-vaccine production into an industrial environment. The lack of genome is actually one of the parameters that restrain the establishment of an efficient quantification method for these particles. Consequently, the development of production and purification methods are considerably hindered as the analytical techniques are limited to indirect and imprecise methods developed for total proteins (SDS-PAGE, Western-Blot, total protein quantification) or some specific proteins such as HA (SRID, HA assay).
The objectives of this research master are related to the VLP manufacturing process with a specific focus on the study of the production in insect cell culture and the set-up of a
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quantification method that is able to support the development of this new generation influenza sub-unit vaccine.
Initially, VLP production has been studied with an expression system including recombinant baculoviruses (rBV) expressing the HA, NA, and M1 matrix proteins in Sf9 and High Five insect cells. The particles produced in Sf9 cells were analyzed, after purification, by SDS-PAGE, Western-Blot and electron microscopy. The latter analysis detected an important contamination (about 100 to 1000 times superior to the VLP contents) by the baculovirus used for VLP production. Although another step of purification has been added, it was impossible to efficiently separate the VLP from the surrounding contamination. Modifications of the production (e.g. host cell system, cell concentration at infection, choice of MOI, ratio between the baculoviruses) and the purification parameters (e.g. culture treatments previous to harvest) did not give any improvement in the expression and purity levels of VLP. Furthermore, during these trials, the baculovirus constructions available, especially the rBV-HA, showed some infectious instability over time, leading to low production yields. Consequently, the VLP production optimization workplan was significantly delayed.
In addition to the production experiments, the development of a reversed-phase HPLC method was investigated in order to quantify the HA concentrations directly from the culture supernatant. A fast and accurate procedure, based on preliminary developments made by other research groups on vaccine doses, was found to detect and quantify the HA concentrations in the HEK 293 cell cultures infected by the A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) influenza virus. Experiments based on distinct viral strains demonstrated the potential of this method to analyze HA protein associated with different viral strains. Consequently, this method appears as a very effective and rapid screening technique for different VLP production strategies.
Author: Alexandre Lennaertz
Language: French
Subfield: Epidemiology
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W77885983