Characterization of in vitro models for evaluation of molecular mechanisms involved in the action of Acetyl-L-Carnitine
Year: 2014
Type: dissertation
Abstract: Pensa-se que a acetil-L-carnitina (ALC) tem ação neuroprotetora, principalmente por prevenir a disfunção mitocondrial no sistema nervoso central e periférico. A ALC é bem conhecida por afetar o metabolismo e a bioenergética do cérebro, e por isso é expetável que alguns dos mecanismos envolvidos na sua ação possam estar relacionados com o metabolismo e absorção de glucose. No entanto, os mecanismos subjacentes à ação da ALC não são ainda bem conhecidos. Os modelos celulares são ferramentas úteis para estudar vias de sinalização celular. Devido ao papel fundamental dos astrócitos no metabolismo cerebral, é essencial estudar-se a função da ALC também neste tipo celular. Pretende-se com este trabalho caracterizar uma linha celular de astrócitos, a C8-D1A, sob a ação da ALC. Para avaliar a capacidade neuroprotetora da ALC usámos uma droga neurotóxica bem conhecida, a metanfetamina (METH, do inglês “Methamphetamine”). Os efeitos das diferentes doses de ALC e METH nos neurónios primários do hipocampo, linhas celulares PC12 e bEnd.3 foram também alvo deste estudo, uma vez que, em estudos futuros, será essencial a utilização co-culturas de astrócitos e neurônios ou células endoteliais para melhor se entender o papel da ALC e as vias de sinalização utilizadas. Começamos por caracterizar a ação de cinco doses diferentes METH (3, 1, 0,5, 0,1 e 0,01 mM) nos diferentes tipos celulares. Em segundo lugar, as doses apropriadas de METH selecionadas foram utilizadas para caracterizar o suposto efeito protetor da ALC 0,1 e 1 mM. Vários parâmetros foram avaliados, incluindo morte celular (ensaio de LDH), morfologia (marcação com faloidina) e atividade mitocondrial (ensaio de MTT). Nas células C8-D1A, foram avaliados também os níveis de produção de ATP, a taxa morte apoptótica (marcação com Hoechst 33342) e a expressão de genes selecionados (Igf1 e Rnd2) (RT-PCR). As avaliações foram realizadas em diferentes pontos do tempo, 24 h e 72 h. Os resultados mostraram que as células C8-D1A foram resistentes a doses variadas até 1 mM. Os neurónios primários do hipocampo expostos a METH 1 e 0,5 mM após 24 h apresentaram um aumento na arborização neuronal e na agregação de actina face ao controlo, enquanto as células expostas a METH 3 e 1 mM após 72 h apresentaram perda de terminais nervosos e morte celular. A linha celular bEnd.3 tratada durante 72 h com METH 3 e 1 mM perderam a sua conformação típica. Ao estudar os efeitos do pré-tratamento com ALC na atividade mitocondrial, os resultados mostraram que as células C8-D1A sob a ação combinada da ALC e METH 1 mM sofreram um aumento do número de núcleos apoptóticos, embora estes valores não ultrapassassem os 3%. Curiosamente, esta dose de METH reduziu a síntese de ATP sem afetar a sua viabilidade mitocondrial, e a ação combinada de ALC e METH não impediu este efeito. Na linha celular bEnd.3, nenhum efeito da ALC foi observado em qualquer uma das condições. Os resultados preliminares parecem indicar que a METH e a ALC interferem com o metabolismo celular da linha C8-D1A, afetando os níveis de transcrição de Igf1. Os resultados deste estudo permitiram fazer a seleção de um intervalo de doses de METH adequado para investigar as vias envolvidas na ação da ALC, e permitiu também pré-visualizar a forma como as culturas neuronais e endoteliais reagiriam às doses selecionadas, em co-cultura com os astrócitos. Estudos futuros serão importantes para a compreensão do real potencial do ALC como agente terapêutico.
Author: Joana Filipa Ramos Lapa
Language: English
Subfield: Neurology
Field: Neuroscience
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W857927989