Year: 2006
Type: dissertation
Abstract: In dieser Studie wurden „single chain fragment variable” (scFv) gegen Schlüsselproteine des Tomato leaf curl virus-India mit Hilfe des „Phage Display” und der Hybridoma Technologie hergestellt. Zur Immunisierung von Mäusen und zum Screenen der „Phage Display” Bibliotheken und der Hybridoma Klone wurden aufgereinigte virale Proteine (AV1: Hüllprotein; AC1: Replikase Enhancer) verwendet. Die Bindungseigenschaften der isolierten scFvs wurden durch Western Blot, ELISA und BIACORE charakterisiert. Das fehlende Nukleotid, das in dem vom Hybridoma Klon abstammenden scFv-SAV gegen AV1 gefunden wurde, wurde wieder hergestellt und der resultierende scFv (scFv-RW-AV) zeigte bessere Bindungseigenschaften als der scFv-SAV. Vier scFv gegen AV1 wurden aus der naïven Tomlinson Bibliothek erhalten. Zwei davon enthielten ein Stop-Codon, das in vitro so mutiert wurde, dass es entweder für Glutamin (Q) oder Glutaminsäure (E) kodierte. Der scFv mit der Q-Mutation zeigte höhere Expressionslevel aber geringere Bindungsaktivität als der mit der E-Mutation. Zusätzlich wurden zwei scFv gegen AC1 selektiert. Alle scFv wurden als N-terminale GFP-Fusionen in Tabakblätter kloniert und cytosolisch exprimiert. Darüber hinaus wurden zwei scFv-GFP Fusionen durch ein N-terminales nukleares Lokalisationssignal (NLS) zum Kern dirigiert. Beide scFv-GFP Fusionsproteine wurden ausschließlich im Kern lokalisiert. Das AV1 Protein wurde daneben als N-terminale DsRed-Fusion in Tabakblättern exprimiert. Die AV1-dsRed Fusion war nur im Kern lokalisiert. Die Bindungsaktivität der AV1-spezifischen scFvs wurde durch Koexpression der scFv-GFPFusion und AV1-dsRed getestet. Nur der vom Hybridoma Klon abstammende scFv zeigte Bindung und der Proteinkomplex wurde durch die AV1 NLS zum Kern geleitet. Die Daten dieser Arbeit zeigen die erfolgreiche Expression von spezifischen und funktionalen scFvs gegen virale Proteine in der reduzierenden Umgebung des pflanzlichen Cytosols. Solch ein scFv ist ein potentieller Kandidat um den viralen Lebenszyklus zu beeinflussen und so eine virale Infektion zu verhindern oder zu verzögern.
Source: RWTH Publications (RWTH Aachen)
Authors: Mohammed Adel Zakri, Rainer Fischer
Language: English
Topic: Plant Virus Research Studies
Subfield: Plant Science
Domain: Life Sciences
SDG: Zero hunger
Open Access status: green
OpenAlex ID: W912383623