Experimentelle Untersuchungen zur Bedeutung von Wachstums- und Gerinnungsfaktoren bei der Entstehung maligner Ergüsse
Year: 2010
Type: dissertation
Abstract: Etwa 15-20 % aller Tumorpatienten entwickeln im Verlauf ihrer Erkrankung einen pleuralen oder peritonealen Erguss. In Anbetracht der kurzen Überlebenszeit von im Mittel 20 Wochen ist bei der Therapie maligner Ergüsse die Beseitigung der durch den Erguss hervorgerufenen Symptome und Beschwerden das zentrale Ziel. Bisher gibt es keine befriedigende Behandlung maligner Ergüsse, da nur eine begrenzte Patientenzahl körperlich in der Lage ist, sich einem invasivem Eingriff mit abschließender Pleurodese zu unterziehen. Andererseits treten nach Punktion häufig Rezidive auf. In der vorliegenden Arbeit wurden Studien zu der Bedeutung von VEGF, in dessen Funktion als Permeabilitätsfaktor, bei der Entstehung maligner Ergüsse durchgeführt. Ziel der Studien war es, die Option einer Anti-VEGF-Therapie mit dem gegen VEGF neutralisierend wirkenden Antikörper Bevacizumab zur Behandlung maligner Ergüsse präklinisch zu untersuchen. Mit der Bestimmung der Permeabilität markierter löslicher Verbindungen und der Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) wurden zwei literaturbekannte Verfahren herangezogen, um epitheliale Permeabilitätsveränderungen zu quantifizieren. Da der experimen-telle Aufbau TEER-Messungen bei unterschiedlichen Temperaturen erforderte, musste die aus der Literatur bekannte Temperaturabhängigkeit der TEER-Messung berücksichtigt werden. Dazu wurde erstmalig eine mathematische Lösung erarbeitet, mit der temperaturunabhängige TEER-Werte unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erhalten werden können. Um möglichst in vivo Bedingungen zu simulieren, wären die VEGF-vermittelten Permeabilitätsveränderungen idealerweise an der Pleura parietalis untersucht worden. Daher wurde die Pleura parietalis vom Schwein in eine im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Apparatur eingespannt. Da die Studien an der Pleura jedoch zu wenig reproduzierbaren Ergebnissen führten, wurde mit dem Caco-2 Monolayer ein Zellkultur basiertes Modell etabliert. Aus der Literatur sind drei VEGF-Rezeptoren bekannt. Die Bedeutung des VEGF-R2 für VEGF-vermittelte Permeabilitätsänderungen konnte mittels VEGF-R2-spezifischer siRNA oder Rezeptor-Antagonisten auch für Caco-2 Monolayer gezeigt werden. In früheren Studien wurde bereits im Tiermodell die Option einer intrakavitären Bevacizumab-Therapie mit dem Ziel, die VEGF-vermittelte Hyperpermeabilisierung und damit die Ergussentstehung zu hemmen, untersucht. Da die Zulassung von Bevacizumab die Therapie maligner Ergüsse bisher nicht umfasst, sind auch keine Empfehlungen für eine Dosierung bei dieser Indikation gegeben worden. In der vorliegenden Arbeit konnte am Modell des Caco-2 Monolayers für Bevacizumab eine Dosis-Wirkungskurve gezeigt werden. Die maximale Verminderung der Permeabilität wurde für eine Bevacizumab-Konzentration von 2,53 mg/ml nachgewiesen. Eine ED50 von 0,7 mg/ml wurde berechnet. Da die aus der ED50 resultierenden hohen Antikörper-Konzentrationen die nach bisher empfohlenen Dosierung resultierenden Plasmaspiegel deutlich überschreiten, stellte sich die Frage nach der Applikationsart. Die erstmalig an Caco-2 Monolayern durchgeführten Permeabilitäts-studien zeigten eine schlechte Permeabilität von Bevacizumab. Die Ergebnisse legen eine intrakavitäre Applikation nahe, da sie auf eine nur minimale Permeabilität vom Plasma in den Erguss hinweisen. Die intrakavitäre Applikation scheint aber auch vor dem Hintergrund sinnvoll, dass epidemiologische Studien in dieser und in früheren Arbeiten gezeigt haben, dass die VEGF-Konzentration gerade im Erguss deutlich erhöht ist. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass aus Ergüssen isolierte Zellen VEGF freisetzen können und somit direkt kausal für hohe VEGF-Spiegel in malignen Ergüssen sein können. Zur Aufklärung der Expression und Freisetzung von VEGF durch isolierte Primärzellen, wurden in den Ergüssen befindliche mögliche Stimulanzien der VEGF-Expression quantifiziert. Anschließend wurden sowohl die aus dem Erguss isolierten Zellen als auch verschiedene Zell-linien mit den Gerinnungsfaktoren FIIa und FXa sowie dem Chemokin IL-8 und dem Wachstums-faktor TGF-ß1 behandelt. Es zeigte sich, dass TGF-ß1 sowohl die VEGF-mRNA als auch die VEGF-Freisetzung am stärksten induziert. Daneben konnte lediglich für FIIa eine signifikante Steigerung der VEGF-Freisetzung nachgewiesen werden. Der PAR-2-Agonist, der anstelle von FXa eingesetzt wurde, zeigt nur eine schwache Induktion und IL-8 blieb ohne Wirkung auf die VEGF-Expression. Die Tendenz der Ergebnisse war bei allen untersuchten Zellen vergleichbar. Unterschiede konnten lediglich im Unfang der Effekte belegt werden. Untersuchungen inwieweit FIIa, FXa, IL-8 und TGF-ß1 in Konzentrationen, in denen sie auch in den Ergüssen nachweisbar waren, die Permeabilität des Caco-2 Monolayers beeinflussen können, ergaben lediglich für TGF-ß1 signifikante Effekte. Ein Anstieg der Permeabilität um gemittelte 20 % war nachweisbar. Inwieweit diese Effekte VEGF-abhängig sind, wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Erste Experimente deuten allerdings darauf hin, dass zunächst ein VEGF-unabhängiger Effekt für die Hyperpermeabilisierung verantwortlich ist, bevor dieser von einer VEGF-abhängigen Komponente abgelöst wird.
Author: Lars-Fabian Blume
Language: German
Subfield: Pulmonary and Respiratory Medicine
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W953964507