Year: 2014
Type: dissertation
Abstract: tratamiento efectivo que cure la enfermedad de forma definitiva, por lo que éste está destinado únicamente a mejorar la sintomatología (Ilustración 3, foto 2, tabla 1 y 2).Pese a que no se conocen los mecanismos responsables de la iniciación y mantenimiento en el tiempo del proceso inflamatorio intestinal, se considera que en su fisiopatología están implicados componentes de tipo genético, ambiental e inmunológico.Desde el punto de vista mecanístico la diarrea puede estar producida por un incremento en la secreción, por una disminución de la absorción, por una fuga de líquido propiciada por defectos en la barrera epitelial, o por una combinación de estos factores.Sin embargo, el escenario con el que nos encontramos en la EII, con diarrea de tipo crónico, es diferente.Así, podemos identificar alteraciones a nivel de secreción y a nivel de absorción intestinal. Alteraciones en la secreciónNumerosos mediadores proinflamatorios se comportan como agentes secretagogos in vitro, como las prostaglandinas [6], los leucotrienos [7,8], el factor activador de plaquetas [9], la histamina [10], la serotonina [11], la IL-1 [12,13], el TNF [14,15], las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno [16], e incluso homogenados de tejido humano afectado por EII [17].Sin embargo, tanto el transporte iónico basal como la respuesta secretora del tejido inflamado están invariablemente inhibidos, tanto en humanos como en modelos animales de características diversas [17][18][19][20][21][22][23].Por tanto, la secreción iónica no es responsable de la diarrea y en cambio se inhibe en la inflamación crónica, lo que puede interpretarse como una adaptación protectora ante la cronificación del proceso diarreico.La comprensión de este mecanismo tiene un evidente interés, tanto en lo que respecta a la EII como a las posibles implicaciones fisiopatológicas y farmacológicas en la diarrea en general.Además, la inhibición del transporte se prolonga más allá de la resolución de la inflamación [17][18][19][20][21][22][23][24] y afecta también a zonas distales al foco inflamatorio [25].Investigaciones llevadas a cabo por nuestro grupo de investigación han puesto de manifiesto que el defecto en la secreción iónica está relacionado con una producción reducida de AMPc en el epitelio, lo que reduce la activación del canal CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) y en consecuencia la secreción basal y estimulada [26].Aunque se desconoce la causa de la disminución de los niveles de AMPc, existe una clara implicación de la submucosa, dado que la disección de esta capa anula, al Es de destacar que en estudios previos a la parte experimental de esta tesis doctoral se ha llevado a cabo un examen exhaustivo de la situación actual del transporte iónico transepitelial en el intestino inflamado, dando lugar a la publicación de dos revisiones publicadas en revistas de alcance internacional [43,44]. OBJETIVOSLos objetivos iniciales de esta tesis doctoral se centraron en el estudio del efecto de distintos alimentos funcionales en las alteraciones del transporte hidroelectrolítico intestinal en la inflamación colónica, así como una mejor caracterización de la fisiopatología de dichas alteraciones en la EII.Los alimentos funcionales a estudiar fueron el glicomacropéptido bovino y distintos oligosacáridos, como fructooligosacáridos, inulina, oligosacáridos de la leche de cabra y AHCC (Active Hexose Correlated Compound).Sin embargo, en contra de nuestras expectativas, estos agentes mostraron una pérdida sustancial de modulación del transporte iónico, pese a su bien establecida actividad antiinflamatoria intestinal en ensayos preclínicos en modelos de EII.Por ello, decidimos desplazar nuestro campo de investigación a una profunda caracterización de las alteraciones del transporte hidroelectrolítico de la EII como tal, ya que aun hoy día, numerosos interrogantes quedan en el aire, pese a los esfuerzos de diversos grupos de investigación a nivel internacional.Así, proponemos 5 objetivos principales en esta tesis doctoral:1. Llevar a cabo una profunda caracterización de las bases moleculares que hay detrás del defecto a nivel de transporte hidroelectrolítico en el intestino inflamado.Especialmente se busca estudiar si alteraciones a nivel del transportoma pueden explicar este estado hiposecretor.2. Estudiar el origen de la relación entre niveles bajos de AMPc y la inhibición del transporte iónico en la EII.3. Identificar los factores relacionados con la regulación del AMPc epitelial a través de la estimulación de la proteína G i .4. Validar nuestros resultados en muestras humanas, así como mediante el uso de técnicas complementarias, en particular a nivel de genómica funcional.13 5. Llevar a cabo un ensayo técnico por análisis de Western blot debido a la necesidad del uso de controles de carga aplicado a las proteínas transportadoras entre otras. MATERIAL Y MÉTODOSPara llevar a cabo estos objetivos, se emplearon diversas técnicas de cultivo y aislamiento celular, estudios de transporte y permeabilidad por cámara de Ussing, RT-qPCR, microarray, Western blot, inmunohistoquímica y determinaciones celulares por ELISA, LDH, silenciamiento celular o determinación intracelular de AMPc, así como un estudio experimental por colitis inducida por TNBS. RESULTADOSNuestros resultados experimentales pueden ser divididos en tres grandes bloques: BLOQUE I. Para llevar a cabo el estudio de las bases moleculares subyacentes a la inhibición del transporte iónico en la inflamación intestinal, realizamos un análisis genético por microarray comparando colonocitos de rata control con colonocitos procedentes de colitis inducida por TNBS.De las secuencias genéticas alteradas por la inflamación, aproximadamente la mitad están aumentadas, y la otra mitad disminuidas respecto al control (Tabla 9, Figura 4).Después de un análisis detallado de estos cambios, las alteraciones en el transportoma no explican la situación actual de transporte del intestino inflamado (Ilustración 17).Sin embargo, las proteínas reguladoras parecen jugar un papel importante a este nivel.Así, puesto que la vía del AMPc en también objeto de nuestro estudio, observamos alteraciones a nivel de encimas responsables de la síntesis y degradación de este segundo mensajero, como son la AC y la fosfodiesterasa.Concretamente, tres isoformas de AC están inhibidas en inflamación en estos estudios genómicos y postgenómicos: AC5, 6 y 9 (figura 6). BLOQUE II.Puesto a que tras estudiar la expresión de los distintos transportadores de membrana no observamos una correlación directa entre ésta y el estado del intestino inflamado, y puesto a que podría haber vinculación entre los niveles de AMPc y el dicho estado hiposecretor, decidimos centrar nuestros estudios en las diferentes vías que modulan el AMPc y en su estado en condiciones de inflamación.Además intentamos indagar en los mecanismos moleculares que pueden estar implicados en la inhibición de la AC.Así, estudiamos 4 vías celulares en las que el AMPc está implicado: A. CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS: Es hoy día reconocido que las diferentes mediadores proinflamatorios, como las citoquinas IL-1β, TNF α o IFN se encuentran sobreexpresadas en la EII.Además, dichas citoquinas han sido implicadas en alteraciones a nivel de transportadores iónicos intestinales.Así, en éste bloque de experimentos estudiamos la relación entre las citoquinas proinflamatorias, los bajos niveles de AC y la reducción de AMPc en condiciones inflamatorias.Para ello, comenzamos con un modelo de cultivo celular in vitro con células humanas Caco-2.Tras la preincubación 24h con dichas citoquinas, encontramos inhibición de las tres isoformas de AC (5,6 y 9) en los grupos tratados frente al control (Figura 10), menor concentración de cAMP intracelular (Figura 11), así como un estado hiposecretor de las mismas medido por cámara de Ussing (Figura 12).Estos resultados son validados en organoides procedentes de yeyuno de ratón, en donde volvemos a encontrar inhibición de las distintas isoformas de AC en presencia de citoquinas proinflamatorias (Figura 17).Además, el silenciamiento celular mediante partículas lentivirales para AC5 en células T84, o la inhibición de AC en tejido colónico de rata control, presentan un estado hiposecretor en estudios de transporte en cámara de Ussing.B. ÓXIDO NÍTRICO: Estudiamos el papel del óxido nítrico en la inhibición del AMPc en inflamación mediante estudios en cámara de Ussing.Ni secuestrador de óxido nítrico carboxy-PTIO (Figura 25), ni la inhibición de la iNOS con L-NIL (Figura 26), ni el donador de NO NONOato (Figura 27), consiguen implicar al óxido nítrico, al menos de forma única, con la inhibición de la secreción iónica en inflamación.C. OPIOIDES ENDÓGENOS: Debido al mecanismo de acción de los opioides endógenos a través de G i , la proteína que inhibe AC, decidimos estudiar dichos opioides como tal (Figura 28), así como un agonista de receptores δ-opioides: UFP-512 (Figura 29).En ningún caso se explica el estado hiposecretor en inflamación.D. PROSTAGLANDINAS: Por último, decidimos estudiar otros mediadores inflamatorios implicados en la EII: las prostaglandinas, debido de nuevo, a su mecanismo de acción a través de Gi o Gs, modulando así la AC y las concentraciones de AMPc.Como era de 15 esperar, todas tienen efectos prosecretores a nivel basal excepto la prostaglandina D 2 (PGD 2 ) (Figura 30), con una acción mediada fundamentalmente a nivel de submucosa.Por ser la principal prostaglandina antisecretora, la PGD 2 , nos centramos en su mecanismo de acción en inflamación.La PGD 2 tiene dos receptores, DP 1 y DP 2 .DP 1 actúa a través de G s en AC, aumentando así las concentraciones de AMPc intracelulares, mientras que DP 2 actúa a través de G i y reduciendo los niveles de AMPc en el enterocito.El bloqueo de DP 2 con ramatroban, revierte parcialmente el grado hiposecretor en colon distal de ratas colíticas en cámara de Ussing.Cuando intentamos reproducir el efecto de PGD 2
Author: Isabel Romero‐Calvo
Language: English
Topic: Inflammatory Bowel Disease
Subfield: Gastroenterology
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W202034936