Desenvolvimento de um método de PCR específico para detecção de Aspergillus Flavus aflatoxigênico em grãos brasileiros
Year: 2009
Type: dissertation
Abstract: Alimentos em geral são extremamente suscetíveis a contaminação por fungos produtores de micotoxinas que prejudicam a saúde humana e animal, além de causar grandes prejuízos na produção agrícola brasileira. O grupo mais importante de micotoxinas são as aflatoxinas, devido a sua alta toxicidade, propriedades hepatocarcinogênicas e sua ocorrência comum em diferentes alimentos. Grãos brasileiros como o amendoim (Arachis hypogaea), a castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e a castanha-de-caju (Anacardium occidentale L.), são extensivamente afetados pela contaminação por fungos aflatoxigênicos, como o Aspergillus flavus. A contaminação por A. flavus, prejudica de sobremaneira a exportação desses grãos, levando países como o Brasil a grandes perdas econômicas. A detecção de contaminação microbiana e por toxinas envolve sistemas de controle como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), que é um sistema preventivo que busca a produção de alimentos inócuos, utilizando ferramentas de diagnose, quer sejam morfológicas, moleculares ou cromatográficas. Para a realização de um sistema robusto de diagnose molecular de A. flavus aflatoxigênico, a ser incorporado em sistemas de controle como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), o presente trabalho utilizando\na técnica de cromatografia de camada delgada (CCD), caracterizou 63 amostras de A. flavus, isoladas de castanha do Brasil e castanha de caju para a produção de aflatoxinas.\nAnálises de CCD mostraram que 49 isolados são produtores de aflatoxinas e para 14 isolados estas não foram detectadas. Amostras isoladas de A. occidentale foram caracterizadas como produtoras de aflatoxina B1, antes descrito como produtor de aflatoxina G. Análises desses isolados por meio de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) mostraram diversidade genética considerável entre isolados, porém nenhuma correlação com a aflatoxigenicidade. Entretanto, análises com outros primers de RAPD não excluem a possibilidade de utilização de RAPD SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) em um método de diagnose molecular para isolados de A. flavus aflatoxigênicos Regiões espaçadoras intergênicas do DNA ribossomal (rDNA) nuclear (ITS 1 e 2) (Internal Transcribed Spacer) e um região da subunidade pequena do DNA ribossomal do DNA mitocondrial) (mtDNA SSU rDNA), foram utilizadas como regiões candidatas para a detecção específica de A. flavus em um sistema robusto de PCR (Polymerase Chain Reaction) múltipla, por serem conservadas e abundantes no DNA alvo. Além de desenvolvimento e comprovação de especificidade de primers ara a espécie A. flavus e gênero Aspergillus, o presente trabalho apresenta dois sistemas de IAC (Internal Amplification Control) para verificar a confiabilidade do sistema de PCR. Os dois sistemas mostraram limites de detectabilidade em picogramas de DNA alvo de A. flavus. Análises da diversidade genética entre as três espécies de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus e A. oryzae, comparadas com seqüências do Genbank dos genes aflR, aflP e aflQ da via\nbiossintética de aflatoxinas, mostraram que A. flavus possui maior similaridade com A. oryzae do que A. parasiticus, com a maior divergência observada entre os genes aflR e aflP.\nTreze conjuntos de primers foram desenhados com cobertura completa para os três genes e produtos de PCR dos 63 isolados foram seqüenciados para os genes aflP e aflQ. A análise parcial desses genes em 14 isolados representativos de aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos revelou 6 haplótipos de 11 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), onde o haplótipo 6 é o mais freqüente.
Author: Gláucia Emy Okida Midorikawa
Language: Portuguese
Subfield: Plant Science
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2744532839