Year: 2018
Type: dissertation
Abstract: As vesículas extracelulares (EV), particularmente os exossomas, são atualmente alvo de intensa investigação.As EV são mediadores fisiológicos de comunicação intercelular que refletem o fenótipo das células que as secretam, e que têm a capacidade de modular o fenótipo das células alvo.Estas características das EV têm vindo a ser exploradas para diferentes aplicações, nomeadamente para o desenvolvimento de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico de diferentes doenças, bem como para o desenvolvimento de novas terapias, em particular na área do cancro, mas também da medicina regenerativa.Vários estudos in vivo, e também alguns ensaios clínicos, têm vindo a usar EV como veículos de entrega de biomoléculas funcionais.Nestes estudos, EV nativas ou modificadas têm sido administradas através de diferentes vias.Os primeiros estudos em modelos animais e pacientes humanos com administração sistémica de EV demonstraram várias limitações na biodistribuição e retenção das EV administradas.Assim, foi colocada a hipótese de que a incorporação das EV em biomateriais capazes de funcionar como um sistema de entrega poderia constituir uma potencial solução para ultrapassar estas limitações, potenciando o uso eficaz das EV.Deste modo, esta tese teve como objetivo o desenvolvimento de um sistema de entrega de EV que permita a libertação local e controlada das mesmas para efeitos de regeneração óssea.No trabalho desta tese, começou-se por otimizar as condições de cultura de diferentes linhas celulares imunes humanas, THP-1, KG-1 e Jurkat, nomeadamente em relação à concentração de soro do meio de cultura, de forma a obter uma produção de EV com alto rendimento e com grande pureza.As EV produzidas foram caracterizados por microscopia electrónica de transmissão, "nanoparticle tracking analysis", e "western blotting" para marcadores exossomais, o que permitiu demostrar que, para todas as linhas celulares testadas, a população de EV isolada era enriquecida em exossomas.No entanto, a linha celular KG-1 produziu os níveis mais elevados de EV, mantendo a viabilidade celular mesmo a concentrações de soro de 0.1 % (v/v), e por isso estas células foram selecionadas para a produção das EV utilizados para a otimização das condições de incorporação num sistema de entrega.O sistema de entrega construído consistiu numa matriz 3D em quitosano funcionalizada com camadas de quitosano (Ch) e poli-γ-ácido glutâmico (γ-PGA) misturado com EV, depositadas alternadamente num sistema layer-by-layer.A incorporação das EV no sistema de entrega foi observada por microscopia confocal de fluorescência, usando EV previamente marcadas com um corante fluorescente, mas não pôde ser confirmada por espectroscopia de infra-vermelhos.De seguida, o perfil de libertação das EV do sistema de entrega foi testado vi in vitro através da análise dos sobrenadantes do ensaio de libertação por microscopia electrónica de transmissão, após 0, 12 e 24 h de incubação, tendo sido possível identificar EV nestes sobrenadantes concentrados, em particular às 12 e 24 h de libertação.A nível funcional, o sistema de entrega produzido e funcionalizado com EV foi testado para a sua capacidade em promover o recrutamento, bem como a diferenciação osteogénica e condrogénica, de células mesenquimais multipotentes/estaminais do estroma (MSC), responsáveis pela formação do osso.Através de ensaios de microscopia de vídeo em tempo real, foi possível demonstrar que as EV incorporadas no sistema de entrega promoveram um aumento significativo da motilidade das MSC.Para além disso, resultados de expressão génica nas MSC mostraram que o sistema de entrega funcionalizado com Ch e γ-PGA foi procondrogénico, mas que a presença de EV não levou a aumentos significativos da diferenciação das MSC.Em conclusão, foi possível incorporar EV no sistema 3D layer-by-layer de Ch e γ-PGA desenvolvido, que se mantiveram funcionais após libertação.As EV secretadas pelas células KG-1 promoveram o recrutamento das MSC através do aumento da sua motilidade, tal como já descrito para EV de células dendríticas primárias, enquanto que o sistema de entrega funcionalizado com o Ch e γ-PGA promoveu per se a diferenciação condrogénica das MSC.Em conjunto, os resultados obtidos suportam um efeito favorável da incorporação das EV num sistema de libertação controlada, sobre as MSC, sugerindo que as EV podem ser mediadores quimiotáticos deste tipo celular para locais de lesão óssea, onde o sistema de entrega produzido pode estimular a sua diferenciação, promovendo a reparação e regeneração do tecido ósseo.
DOI: 10.34626/66b8-mk63
Author: Pinheiro, Alice Quintas
Language: English
Subfield: Molecular Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
Awards: G1106915579, G1795752003, G274581676, G4372957208, Extracellular Vesicles: can we post the right message to resolve inflammation and promote regeneration in Rheumatoid Arthritis?, G4724859719, G498092695, G5485649731, G5677667711, UID/BIM/04293 .: Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, UNDERSTANDING THE ROLE OF MICROVESICLE/EXOSOME-MEDIATED MICRORNA AND RNA MOLECULES IN TISSUE REGENERATION, Qualidade e Segurança Alimentar — uma abordagem (nano)tecnológica, G7965899483, G96847669
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