Tripartite multidrug efflux pumps in the human pathogen Salmonella typhimurium
Year: 2017
Type: dissertation
Abstract: Der intrazelluläre Krankheitserreger Salmonella infiziert sowohl menschliche als auch tierische Wirte und ist eine häufige Ursache von Lebensmittelinfektionen. Abhängig von der Subspezies kann er entweder eine Magen-Darm-Infektion oder eine systemische Erkrankung verursachen. Während in leichten Fällen meist keine besondere Behandlung notwendig ist, werden schwerere Formen der Krankheit mit Antibiotika behandelt. Dabei ist die Evolution von multiresistenten Stämmen ein wiederkehrendes klinisches Problem bei Salmonella wie auch bei anderen Gram-negativen Bakterien, etwa E. coli oder Pseudomonas aeruginosa. Die Multiresistenz betrifft nicht nur Antibiotika, sondern auch andere toxische Substanzen wie Detergentien und Desinfektionslösungen und ist oft verbunden mit einer erhöhten Fähigkeit der Bakterien, diese Substanzen mit Hilfe von aktiven Membrantransportern zu exportieren. Diese sogenannten „multidrug efflux pumps“ reichen in Gram-negativen Bakterien oft durch beide Membranen und bestehen aus drei Komponenten in unterschiedlicher Kopienzahl: i) einem Transporter in der inneren Membran, der die Energie für den Substrattransport liefert, ii) einem Kanal in der äußeren Membran, und iii) einem periplasmatischen Adaptorprotein, welches als verbindendes Element zwischen den beiden dient. Basierend auf ihrer Funktionsweise werden diese Effluxpumpen eingeteilt in primäre Pumpen, die ATP als primäre Energiequelle verwenden, und sekundäre Pumpen, die als Ionen/Substrat Antiporter wirken und die elektrochemische Potentialdifferenz an der inneren Membran ausnutzen. Die vorliegende Studie untersucht je ein Mitglied beider Klassen: Ausgewählt wurden MacAB-TolC als der wichtigste Repräsentant der tripartiten Pumpen vom ABC-Typ sowie der Proton/Substrat Antiporter AcrAB-TolC, der die klinisch relevanteste und am besten untersuchte tripartite Effluxpumpe ist. Die detaillierte Struktur und der Assemblierungsmodus des MacAB-TolC Komplexes ist großteils unbekannt, während zur AcrAB-TolC Pumpe bereits einige strukturelle Studien durchgeführt wurden – allerdings keine davon mit dem nativen Proteinkomplex. Während meiner experimentellen Arbeit konnte ich beide Effluxpumpen direkt im Ursprungsorganismus (S. enterica serovar Typhimurium) überexprimieren, wodurch die Assemblierung unter nativen Bedingungen erfolgen kann. Ein etabliertes Protokoll ermöglichte die Isolierung aus Membranfraktionen und die Visualisierung von beinahe-nativen Effluxpumpen in „negative-stain“ Elektronenmikroskopie sowie im Falle von AcrAB-TolC auch in der Kryo-Elektronenmikroskopie. Für die individuelle Expression der zwei Pumpen wurde ein Deletionsstamm generiert, in dem keine anderen wichtigen tripartiten Effluxpumpen stark exprimiert werden, die die verlässliche Identifikation und Zuordnung der sichtbaren Partikel stören könnten. Weiters wurde die periplasmatische Komponente von MacAB-TolC aufgereinigt und für die Produktion polyklonaler Antikörper verwendet, und die Funktionalität der Plasmid-exprimierten Pumpen wurde bestätigt. Wir hoffen, dass unsere Bemühungen zu einem besseren strukturellen und mechanistischem Verständnis der tripartiten Effluxpumpen führen und zur Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung multiresistenter Keime beitragen können
Source: University of Vienna
Author: Tietscher, Sandra
Language: German
Subfield: Microbiology (medical)
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2945438740