Miniaturization of a screening method to find novel inhibitors of E. coli efflux pumps
Year: 2019
Type: dissertation
Abstract: Tausta: Antibiootit ovat olleet tärkeä tekijä bakteeriperäisten infektiotautien kuolleisuuden romahduksessa 1900-luvulla. Bakteerit ovat kuitenkin erittäin tehokkaita mukautumaan ympäristönsä muutoksiin lyhyen elinkaarensa vuoksi. Näin ollen bakteerien antibioottiresistenssin kehitys on luonnollisesti seurannut valtavaa maailmanlaajuista antibioottien käyttöä. Nykyinen tilanne on, että bakteerien antibioottiresistenssi kehittyy nopeammin kuin uusia antibiootteja löydetään ja kehitetään. Gram-negatiivisten bakteerien kolme pääasiallista resistenssistrategiaa ovat: antibiootin kohderakenteen muokkaus, antibiootin entsymaattinen inaktivaatio ja solun sisäisen antibioottikonsentraation laskeminen ulkokalvon toimintaa muokkaamalla. Bakteerit laskevat solun sisäistä antibioottikonsentraatiota muun muassa efluksipumpuilla, joista merkittävimpiä antibioottiresistenssin kannalta ovat RND-perheen effluksipumput. RND-efluksipumput toimivat tyypillisesti osana kolmiosaista rakennetta, joka mahdollistaa antibioottien pumppaamisen solun ulkoiseen tilaan. RND-pumppuja vastaan on kehitetty useita inhibiittoreita, mutta yksikään ei ole saavuttanut lääkekehityksen kliinistä vaihetta. Tavoitteet: 384-kuoppalevyformaatissa toimivan seulontamenetelmän kehittäminen E. colin (BAA1161) efluksipumppuinhibiittorien seulomiseen, sekä kehitetyn menetelmän testaaminen. Menetelmät: Absorbanssimittauksen riittävän herkkyyden varmistaminen bakteerikannan (BAA1161) kasvun seurantaan 384-kuoppalevyformaatissa. Seulontamenetelmässä käytettävän antibiootin (piperasilliini) ja positiivisena kontrollina käytettävän efluksipumppuinhibiittorin (meflokiini) BAA1161 kasvua estävän konsentraation (MIC) määrittäminen sekä 96- että 384-kuoppalevyformaatissa. Piperasilliinin ja meflokiinin BAA1161:n kasvua estävän synergian varmistaminen 96- ja 384-kuoppalevyformaateissa checkerboard-menetelmällä. Sijainnin vaikutuksen selvittäminen 384-kuoppalevyllä. Korkeimman BAA1161:n kasvuun vaikuttamattoman DMSO-konsentraation määrittäminen 384-kuoppalevyformaatissa. 126 luontoperäisen yhdisteen seulominen 384-kuoppalevyillä kehitetyn menetelmän testaamiseksi. Seulonta suoritettiin neljällä rinnakkaisella näytteellä perustuen seulottavien yhdisteiden bakteerin kasvua estävään vaikutukseen piperasilliinin kanssa. Yhdisteille, jotka osoittivat seulonnassa BAA1161:n kasvua estävää vaikutusta, suoritettiin annos-vaste -kokeet sekä piperasilliinin kanssa että ilman 384-kuoppalevyllä. Tulokset ja pohdinta: Absorbanssimittaus osoittautui riittävän herkäksi menetelmäksi BAA1161:n kasvun mittaamiseen 384-kuoppalevyllä. 96- ja 384-kuoppalevyillä meflokiinin MIC-arvoksi saatiin 32 μg/ml. Piperasilliinin MIC-arvoksi saatiin 1024 μg/ml 96-kuoppalevyllä, mutta 384-kuoppalevyllä MIC-arvossa oli vaihtelua. Piperasilliini ja meflokiini osoittivat synergistista BAA1161:n kasvun estoa checkerboard-kokeissa. Kuopan sijainnin mahdollista vaikutusta menetelmän tuloksiin ei voitu arvioida, koska piperasilliinin vaikutuksessa BAA1161:n kasvuun oli suurta sattumanvaraista vaihtelua. Tämä sattumanvaraisesti toistuva ilmiö, jossa piperasilliini esti osassa kuoppia kokonaan tai lähes kokonaan BAA1161:n kasvun pitoisuudella joka oli alle MIC:n, toistui myös kaikissa seuraavissa kokeissa 384-kuoppalevyllä. Yksi mahdollinen syy tähän 384-kuoppalevyformaatissa toistuvaan ilmiöön on BAA1161 kannan heterogeenisyys piperasilliiniresistenssin suhteen. Testiseulonnassa neljä yhdistettä, jotka kaikki sisälsivät gallushappoesterin, osoittivat lupaavaa aktiivisuutta. Nämä yhdisteet olivat: epigallokatekiinigallaatti, hamamelitanniini, isopropyyligallaatti ja oktyyligallaatti. Hamamelitanniinin ja oktyyligallaatin teho osoittautui synergistiseksi piperasilliinin kanssa annos-vaste-kokeessa. Johtopäätökset: Kehitettyä menetelmää voidaan hyödyntää uusien efluksipumppuinhibiittorien seulontaan. Menetelmän jatkokehittäminen lienee kuitenkin järkevää piperasilliinin vaikutuksen vaihtelun poistamiseksi ja siten menetelmän luotettavuuden lisäämiseksi. Menetelmän kuoppalevyformaattia vaihdettaessa tulisi myös kiinnittää erityistä huomiota tekijöihin jotka saattavat vaikuttaa menetelmän toimivuuteen uudessa formaatissa. Testiseulonnan perusteella gallushappoesterit ovat kiinnostava yhdisteryhmä, joiden antibioottien tehoa lisäävää vaikutusta kannattanee tutkia lisää tulevaisuudessa.
Source: Työväentutkimus Vuosikirja
Author: Sampo Kurvonen
Language: English
Subfield: Microbiology (medical)
Field: Medicine
Domain: Health Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W2980603333