Capturing functional states of macromolecules in situ with cryo-electron tomography
Year: 2026
Type: dissertation
Abstract: Um biologische Prozesse auf molekularer Ebene zu verstehen, müssen die Strukturen der Makromoleküle untersucht werden, die diesen Prozessen zugrunde liegen. Die dicht gedrängte zelluläre Umgebung, in der sich die Makromoleküle natürlicherweise befinden, war lange Zeit für hochauflösende strukturbiologische Methoden nicht zugänglich. Dadurch besteht eine Wissenslücke zwischen hochaufgelösten in vitro Strukturen und ihrer Gültigkeit innerhalb von Zellen. Die in situ Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ermöglicht die dreidimensionale Visualisierung der Struktur und Organisation von Makromolekülen in ihrer zellulären Umgebung. Da Kryo-ET dünne, elektronentransparente Proben erfordert, müssen die meisten Zellen in dünne Schnitte, sogenannte Lamellen (100-250 nm dick), ausgedünnt werden müssen durch einen fokussierten Ionenstrahl (FIB). Nach dem Prozess des Kryo-FIB-Lamellenfräsens wird die Probe in einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) unter verschiedenen Neigungswinkeln abgebildet. Die zweidimensionalen TEM-Bilder werden dann in dreidimensionale Volumina (Tomogramme) rekonstruiert, anhand derer sich Makromoleküle in ihrem komplexen zellulären Kontext analysieren lassen. Diese Technik ist jedoch noch nicht ausgereift und lässt viele Fragen über ihre Anwendbarkeit auf verschiedene biologische Fragestellungen offen. In dieser Dissertation wurden methodische Grenzen und Anwendungen der in situ Kryo-ET in eukaryotischen Zellen untersucht. Die Arbeit ist in drei Hauptthemen gegliedert. Zuerst, die Bestimmung von Ribosomenstrukturen und Translationsdynamiken in situ, dann die systematische Bewertung technischer Kryo-ET Parameter und zuletzt die Untersuchung des Zellkerneintritts des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1). Im ersten Teil wurden hochaufgelöste in situ Strukturen eukaryotischer Ribosomen aus der Amöbe Dictyostelium discoideum und menschlichen HEK-293-Zellen bestimmt. Beide Datensätze erreichten Auflösungen im Bereich von 3-4 Å und zeigten, dass sich selbst Seitenketten und gebundene Liganden, wie das Krebsmedikament Homoharringtonin (HHT), klar erkennen lassen. Damit wurde erstmals demonstriert, dass FIB-Lamellen-Kryo-ET nahezu atomare Auflösungen erreichen kann. Darüber hinaus konnte erstmals der Translations-Elongationszyklus der Ribosomen direkt in eukaryotischen Zellen bestimmt werden. Sowohl in D. discoideum als auch in HEK-Zellen zeigte sich, dass der am häufigsten besetzte Zustand der Codon-Erkennung entspricht. Dies steht im Gegensatz zu früheren in vitro Studien. Eine Behandlung der HEK-Zellen mit HHT führte zu einer deutlichen Anreicherung inaktiver ribosomaler Zustände und verdeutlicht somit den Wirkmechanismus des Moleküls auf molekularer Ebene in situ. Die beiden Studien zeigen insgesamt, dass in situ Kryo-ET nicht nur detaillierte Strukturen liefern, sondern auch funktionelle Zyklen von Makromolekülen in ihrer natürlichen Umgebung sichtbar machen kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurden grundlegende technische Parameter der FIB-Lamellen-Kryo-ET systematisch untersucht. Es wurde gezeigt, dass Lamellendicken über 180 nm niedrigere Ribosomenauflösung liefern, es aber keinen Vorteil für besonders dünne Lamellen unter 150 nm gibt. Für Gallium-Ionen konnte eine maximale, durch den Ionenstrahl verursachte Schadenstiefe von 30 nm bestimmt werden. Diese Erkenntnisse sind direkt für die Probenpräparation relevant, da sie Hinweise auf eine optimale Lamellendicke und den Einfluss ioneninduzierter Beschädigungen liefern. Ein weiterer methodischer Schwerpunkt lag auf der Verbesserung des Template Matching (TM). TM ist ein Partikelerkennungsverfahren, bei dem eine Vorlage des Zielmakromoleküls über das gesamte Tomogramm gerastert wird und Punkte mit hohen Kreuzkorrelationswerten für die weitere Verarbeitung ausgewählt werden. Durch optimierte Suchparameter konnte die Konfidenz der Partikeldetektion deutlich erhöht werden. Das Verfahren ermöglichte erstmals eine robuste Detektion der Untereinheiten des Kernporenkomplexes (NPC) und wurde in späteren Arbeiten für die Untersuchung von NPC-Heterogenität eingesetzt. Im dritten Teil der Arbeit wurde mithilfe von in situ Kryo-ET der Eintritt von HIV-1 in den Zellkern untersucht. HIV-1 infiziert hauptsächlich nicht-teilende Immunzellen wie T-Helferzellen und Makrophagen. Hierfür muss das virale Genom, das von einer Kapsidhülle umgeben ist, durch den NPC in den Zellkern gelangen, um dort in das humane Genom integriert zu werden. Es ist unklar, welche strukturellen Änderungen beim HIV-1-Kerneintritt am Kapsid und am NPC verursacht werden. Frühere Modelle gingen von einem Aufbrechen der Kapsidhülle im Zytoplasma oder am NPC aus. Mithilfe von in situ Kryo-ET konnte gezeigt werden, dass das Kapsid weitgehend intakt bleibt und den NPC als geschlossene Struktur durchquert. Außerdem wurde gezeigt, dass ein Wirtsprotein, Cyclophilin A (CypA), cytoplasmatische Kapside beschichtet. Analysen mit TM der NPC-Untereinheiten zeigten zudem, dass der NPC beim Durchtritt des Kapsids lokal aufbricht. Molekulardynamik-Simulation deuteten darauf hin, dass dieses Aufbrechen den Durchtritt des Virus durch den NPC erleichtern könnte. Die Ergebnisse unterstützen ein Modell, in dem das HIV-1 Kapsid zunächst an den NPC andockt und dort seinen CypA-Mantel verliert, der das Kapsid vermutlich vor Beschädigung im Zytoplasma schützt. Anschließend dringt das Kapsid in den zentralen Kanal des NPC ein, bricht dort das NPC-Gerüst auf, um weiter in den Kanal vorzudringen. Schließlich dissoziiert das Kapsid im Nukleus vom NPC. Die in dieser Dissertation beschriebenen Arbeiten zeigen, dass in situ Kryo-ET inzwischen Auflösungen im atomaren Bereich erreichen und gleichzeitig funktionelle Zustände komplexer Makromoleküle erfassen kann. Durch methodische Optimierungen und strukturelle Analysen wurde die Anwendbarkeit der Technik erweitert von der Untersuchung von Translation und Ribosomenfunktion bis hin zur Untersuchung viraler Infektionsmechanismen. Die gewonnenen Erkenntnisse liefern nicht nur neue Einblicke in die Biologie von HIV-1, sondern etablieren in situ Kryo-ET als zentrales Werkzeug zur strukturellen Zellbiologie der Zukunft.
DOI: 10.21248/gups.99153
Author: Jan Philipp Kreysing
Language: German
Subfield: Structural Biology
Domain: Life Sciences
Open Access status: green
OpenAlex ID: W7170378296